BỆNH của các sinh vật thủy sản

Dis Aquat Org. 67: 163-169, 2005 đăng ngày 09 tháng 11

GIỚI THIỆU

Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) lần đầu tiên được ob-

phục vụ ở Texas, Mỹ, vào năm 1985 và sau đó trong

một số nước Nam Mỹ, ví dụ: Peru, Ecuador,

Venezuela, Brazil và Panama. NHP là một nghiêm trọng dis-

dễ dàng trong tôm penaeid gây ra lên đến 95% tử vong

trong ao nuôi bị ảnh hưởng (1990 Johnson, Lightner 1996).

Độ mặn và nhiệt độ cao được coi là nguy cơ

yếu tố mà rất nhiều ảnh hưởng đến sự xuất hiện của NHP

(Frelier và cộng sự năm 1992,. Lightner & Redman 1994, Lightner

1996). Các loài vật chủ báo cáo cho NHP là Litopenaeus

tôm thẻ chân trắng, setiferus L., L. stylirostris Farfantepenaeus

aztecus và F. californiensis (Lightner 1996).

Vi khuẩn NHP (NHPB) là tác nhân gây bệnh

NHP. NHPB là một thành viên của lớp con-α

proteobacteria và gram âm, pleomorphic,

buộc bên trong tế bào mầm bệnh như rickettsia. Đó là

© Inter-Nghiên cứu 2005 www.int-res.com * Tương ứng với tác giả. Email: jeff.lotz @ usm.edu

Thời gian khoá học của hepatopancreatitis hoại tử

(NHP) Litopenaeus thử nghiệm bị nhiễm bệnh

tôm thẻ chân trắng và định lượng của vi khuẩn-NHP

bằng cách sử dụng real-time PCR

Amanda G. Vincent, Jeffrey M. Lotz *

Sở Khoa học ven biển, Đại học Nam Mississippi, Phòng thí nghiệm nghiên cứu Gulf Coast, PO Box 7000,

Ocean Springs, Mississippi 39566-7000, USA

Tóm tắt: hepatopancreatitis hoại tử (NHP), một vi khuẩn bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến penaeid

tôm nuôi trồng thủy sản, được gây ra bởi một gram âm, pleomorphic, nội bào α-proteobacterium

được gọi là vi khuẩn NHP (NHPB). Quá trình thời gian của NHP đã được điều tra thực nghiệm

kiểm đếm bị nhiễm bệnh chưa thành niên của Kona chứng khoán Litopenaeus vannamei.Động vật mẫn cảm đã được cá nhân

bị cô lập trong 4 lít nước biển nhân tạo có ga ở độ mặn 30 ± 1 ppt và duy trì trong một cốc nước ở 30 ±

1 ° C trong 60 d. Tổng cộng 120 cá nhân được tiếp xúc với mỗi hệ điều hành cho một mảnh 0,05 g NHPB nhiễm

gan tụy và 100 điều khiển đã được tiếp xúc với các mô không bị nhiễm bệnh. Ở khoảng thời gian 3, 6, 9, 16, 23, 30,

37, 44, và 53 d sau khi tiếp xúc, 6 tôm tiếp xúc với NHPB-mô bị nhiễm bệnh và 4 điều khiển chạy

domly lấy ra từ thí nghiệm, mẫu gan tụy xử lý mô học và

phân tích phân tử, và phân được xử lý để chẩn đoán phân tử của nhiễm trùng NHPB.NHPB được

đầu tiên được phát hiện trong gan tụy thông qua mô học tại 6 d tiếp xúc với hậu. Tất cả tôm kiểm soát được

chẩn đoán như NHPB tiêu cực. Nhiễm trùng NHPB phân loại như giai đoạn I (tán xạ của hepatopancreatic

ống liền kề với các tế bào biểu mô có chứa NHPB) và giai đoạn II (ống nhiều nhiễm

thỉnh thoảng hemocyte xâm nhập) đã được quan sát từ 6 đến 37 d sau phơi nhiễm. Tất cả các loài động vật expe-

rienced NHPB gây ra tử vong từ 16 đến 51 d tiếp xúc với hậu ở giai đoạn III (nhiều hoại tử

ống, xâm nhập hemocyte dày đặc, và sự hiện diện của u hạt). NHPB là có khả năng lây nhiễm tất cả các

hepatopancreatic loại tế bào bao gồm các tế bào phôi thai, resorptive, sợi nhỏ hợp thành và vỉ giống như. Mỗi

phần trăm của các ống hepatopancreatic có chứa NHPB trong các tế bào biểu mô tăng theo thời gian, đại diện

ing nhân vi khuẩn và lây lan. Real-time PCR cho phép định lượng NHPB

gan tụy và phân. Trong quá trình nhiễm trùng, NHPB đã có mặt tại 103

đến 107

bản sao mg-1

gan tụy và 101

đến 105

bản sao mg-1

phân. Nhiễm trùng gây chết người chứa 106

đến 107

bản sao

mg-1

gan tụy và 103

đến 106

bản sao mg-1

phân.

Từ khóa: hoại tử hepatopancreatitis tôm thẻ chân trắng Litopenaeus Real-time PCR - tôm

bệnh · Nuôi trồng thủy sản

Bán lại hoặc republication không được phép mà không có sự đồng ý bằng văn bản của Aquat publisherDis Org 67: 163-169, 2005

có mặt ở 2 dạng hình thái khác biệt, một predomi

Nant thanh hình thức, một dạng xoắn ốc flagellated (Krol et al.

Năm 1991, Frelier et al. Năm 1992, Lightner et al. 1992). NHPB

mục tiêu chủ mô gan tụy, các chỉ báo cáo

trang web của nhiễm trùng NHPB. Động vật bị nhiễm bệnh với NHPB

đặc trưng hiển thị giảm lượng thức ăn ăn, trống rỗng

giữa và phía sau-ruột, vỏ mềm, cơ quan trạng thái bình thường, và

hôn mê. Gan tụy NHPB nhiễm

tôm hiển thị teo đánh dấu và có thể xuất hiện nhạt

với một trung tâm màu trắng. Melanization của hepatopancre

ống ATIC và nhiều u hạt đã được

quan sát thấy trong các nhiễm trùng NHPB nặng (Lightner 1996).

Một số phương pháp chẩn đoán có sẵn cho detec

tion NHPB tôm bao gồm mô học tại chỗ

lai tạo, và PCR (Lightner năm 1996, Loy & Frelier

Năm 1996, Loy et al. 1996a, b). Kháng thể đơn dòng có

được phát triển cho NHPB phát hiện (Bradley-Dunlop

et al. 2004). Briñez et al. (2003) báo cáo phát hiện

NHPB DNA trong các mẫu phân của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus

người lớn, do đó cung cấp một phương pháp không phá hủy

NHPB chẩn đoán bị nhiễm bệnh giống bố mẹ. Tuy nhiên,

có không có báo cáo phương pháp không xâm lấn lấy mẫu

để chẩn đoán của NHPB ở ấu trùng lên hoặc vị thành niên

penaeid tôm. Varner (1998) không phát hiện NHPB

ở ấu trùng bài viết của L. vannamei và đề nghị pres-

ence các chất ức chế PCR hoặc sự bất ổn định của NHPB trong

môi trường bên ngoài có thể là nguyên nhân.

Frelier et al. (1992) phân loại phát triển của NHP

nhiễm trùng ở tôm penaeid thành 3 giai đoạn. Giai đoạn I là

được đặc trưng bởi các ống hepatopancreatic phân tán

triển lãm nhóm của các tế bào có chứa nội bào bac-

teria nhưng thiếu kẽ xâm nhập hemocytic.

Giai đoạn II được đặc trưng bởi nhiều hepatopancre

ATIC ống lót bằng cách phì hoặc suy yếu

biểu mô với ống dãn, ống vài hoại tử,

một số desquamation luminal của các tế bào biểu mô, và

xâm nhập không thường xuyên hemocyte. Giai đoạn III là ký tự

ized bởi nhiều ống hepatopancreatic hoại tử

thiếu biểu mô còn nguyên vẹn và desquamated epithelia

hemocyte xâm nhập các tế bào, dày đặc, melanization, và

fibriosis. Một nội dung lipid giảm của hepatopan

creas dần dần quan sát từ giai đoạn I đến III

NHP bệnh.

Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá quá trình

nhiễm NHPB Litopenaeus tôm thẻ chân trắng theo thời gian

với mục tiêu sau đây: (1) để xác định ông-

patopancreas NHPB biểu mô tế bào loại có khả năng

lây nhiễm; (2) để mô tả thời gian sau phơi nhiễm

của NHP bệnh giai đoạn I, II, III theo phân loại Frelier

et al. (1992), (3) để trình bày một phương pháp không xâm lấn

chẩn đoán nhiễm trùng NHPB trong vị thành niên sử dụng trực tiếp

phân như là một nguồn DNA của NHPB; (4) để xác định số lượng NHPB

tôm mô bằng cách sử dụng các thủ tục cuốn tiểu thuyết PCR thời gian thực

dure; và (5) để so sánh sự nhạy cảm của hiện tại chẩn

nostic công cụ phát hiện sớm NHPB.

TÀI LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thí nghiệm thiết kế. Tổng cộng có 220 người chưa thành niên của

Kona chứng khoán Litopenaeus vannamei trọng lượng có nghĩa là

5,7 g (khoảng 3,0-8,8 g) cá nhân đã được đặt trong

® Sterilite ga container (dài 35 cm, rộng 22 cm

cao 12 cm). Kona chứng khoán L. vannamei từ một

dân số cụ thể tác nhân gây bệnh miễn phí có sẵn thông qua

Hoa Kỳ Chương trình Nuôi tôm biển

(Pruder et al 1995, Lotz et al. 2003). Tôm

duy trì ở độ sâu 9 cm bằng cách sử dụng tinh thể nhân tạo

Biển ® Marinemix nước biển ở độ mặn 30 ± 1 ppt trước

pared từ nước lọc thẩm thấu ngược để một tổng vol

ume của khoảng 4 l. Các vi khuẩn NHP

unculturable thông qua truyền thống vi khuẩn meth

ods, do đó nhiễm trùng NHPB phải được duy trì thông qua

liên tục tiếp xúc với các cổ phiếu không bị nhiễm bệnh Kona L. van

namei cho một dân số trải qua một dịch NHPB.

Tôm cho thấy dấu hiệu nhiễm trùng NHPB tổng

thu được từ hệ thống bảo trì dài hạn

được mô tả bởi Vincent et al. (2004) cho NHPB tiếp xúc

L. vannamei. Gan tụy NHPB nhiễm

tôm được cắt bỏ, nặng 0,01 g gần nhất, và

chia thành 4 khoảng 0.05 phần g. Unin-

fected tôm nhịn ăn trong 3 d được cho ăn một miếng g 0,05

gan tụy NHPB nhiễm, 120 tôm

tiếp xúc với vật chất và kiểm soát 100 NHPB nhiễm

tôm được tiếp xúc với vật liệu NHPB-âm

chế biến từ gan tụy tôm không bị nhiễm bệnh.

Cá nhân tôm ăn 0,05 g mảnh m.

topancreas trong vòng 1 giờ Tôm được duy trì trong một

nước tắm ở 30 ± 1 ° C cho 60 d và nước ngọt

thêm vào các thùng chứa cá nhân chỉ để thay thế eva

poration. Nhiệt độ được theo dõi hàng ngày và độ mặn

hàng tuần. Chất lượng nước của bể cá nhân được accep

bảng. Tôm cá nhân được cho ăn thức ăn viên thương mại tại

khoảng 5% trọng lượng cơ thể mỗi ngày.

Ngày tiếp xúc với tỷ lệ tử vong được ghi nhận

tất cả tôm đã chết trong khoảng thời gian d 60. Dựa trên

quan sát trước đó của quá trình nhiễm trùng NHPB

Kona chứng khoán Litopenaeus vannamei, 6 tôm sống

tiếp xúc với mỗi hệ điều hành để vật liệu NHPB nhiễm và 4

tôm tiếp xúc với vật liệu không bị nhiễm bệnh ngẫu nhiên

gỡ bỏ khỏi thử nghiệm ở khoảng thời gian 3, 6, 9, 16,

23, 30, 37, 44, và 53 d sau khi tiếp xúc và xử lý

kiểm tra mô học phân tử và cho NHPB

nhiễm trùng. Tôm được cắt ngang tại đường giao nhau

cephalothorax và bụng và một mảnh nhỏ của

gan tụy khoảng 25 mg cũ

cised từ phần sau của cephalothorax

và được lưu trữ trong một ống 1,5 ml microcentrifuge -20 ° C

cho phân tích PCR. Phân hoặc thu được từ việc

container có đặt các cá nhân sử dụng tương ứng

một pipette 1 ml dùng một lần, hoặc chiết xuất từ ​​giữa

và phía sau ruột của tôm. Khoảng 250 mg

164Vincent Lotz: Thời gian khoá học của NHP và định lượng vi khuẩn NHP

phân từ tôm từng được đặt trong một 1,5 ml vi-

máy ly tâm ống và được lưu trữ tại -20 ° C cho phân tích PCR.

NHPB DNA trong gan tụy và mẫu phân

mỗi cá nhân đã được trích xuất (Loy et al 1996a.)

phân tích bằng phương pháp PCR (DiagXotics ®) nhắm mục tiêu một bp 312

amplicon.

Davidson của rượu formalin-acetic acid (AFA) fixa

chính kịp thời được tiêm vào mỗi cephalothorax để đảm bảo

định hình toàn diện của gan tụy còn lại.

Cephalothorax được đắm mình trong AFA Davidson

từ 48 đến 72 h, sau đó cắt dọc theo mặt phẳng dọc, đặt

trong mô-Tek ® uni-băng cát-sét, và được lưu trữ trong 70%

ethanol trước khi nhúng paraffin và cắt tại

5 micromet. Các phần của mô nhúng paraffin

kiểm tra bị nhiễm trùng NHPB bởi thói quen hematoxylin

và eosin nhuộm và một sửa đổi Steiner-Steiner sil-

ver vết (Sigma, HT101A) (Lightner 1996). Vào cuối

d tiếp xúc với thời hạn 60, tôm bị thiệt mạng và

xử lý trong cách như.

Phần trăm ống hepatopancreatic chứa

NHPB được ước tính đối với động vật bị phơi nhiễm bằng cách đếm

số lượng các ống có chứa intracytoplasmic

NHPB trong các tế bào biểu mô và của ống không bị nhiễm bệnh

hiện diện trong một phần của màu gan tụy

sửa đổi Steiner-Steiner bạc màu. Biểu mô tế bào

có chứa NHPB intracytoplasmic màu đen,

trong khi các tế bào không chứa NHPB màu nâu. Các

% của các ống hepatopancreatic có chứa NHPB

thu được bằng cách phân chia số lượng NHPB nhiễm

ống bằng tổng số ống có mặt trong một phần mô.

Real-time PCR. Mồi và TaqMan thăm dò cụ thể

cho NHPB được lựa chọn dựa trên gen NHPB

chuỗi cung cấp bởi Loy et al. (1996a) (GenBank

nhập số U65509). PCR mồi và TaqMan

thăm dò được thiết kế bằng cách sử dụng Beacon thiết kế 2 mềm

đồ trang bị trong nhà (PREMIER Biosoft quốc tế). Chuyển tiếp mồi

NHPB396F 'trình tự 5'-CGATAATGACGGTAGC

AGGACAA-3 (23 bp chiều dài) và tương ứng với

nucleotide 396 đến 418 của 1415 bp xuất bản

NHPB trình tự bộ gen. Ngược lại mồi 'NHPB539R'

trình tự là 5'-CCCAGGGCTTTCACACCTTG-3 '

(20 bp chiều dài) và tương ứng với nucleotide 539 để

520 trên sợi đảo ngược. Thăm dò TaqMan

NHPBPrb 'trình tự 5'-CTGGGCGTAAAGGGT

GCGTAGGCG-3 (24 bp chiều dài) và tương ứng với

nucleotide 486 tới 509 trên sợi về phía trước. Các

TaqMan thăm dò được dán nhãn trên kết thúc '5 với 5-carboxy-

fluoroscein (FAM) và kết thúc 3 'với N, N, N', N'

tetramethyl-6-carboxyrhodamine (Tamra the). Các tar-

get thứ tự là 144 bp dài và tương ứng với

nucleotide 396 tới 539 trong bộ gen được công bố

chuỗi NHPB.

Phản ứng PCR thời gian thực đã được tiến hành trên tổng số

khối lượng 25 ml. Hỗn hợp phản ứng bao gồm

3,0 ml vô trùng nước, 2,5 ml Taq DNA Polymerase 10 ×

Buffer với 15 mM MgCl2 (Promega), 0,5 ml của

10 mM PCR nucleotide hỗn hợp (Promega), 2,0 ml 3,0 mM

'NHPB396F' mồi về phía trước (Invitrogen), 2.0 ml của

3,0 mM 'NHPB539R mồi ngược (Invitrogen), 2.0 ml

25 MgCl2 mM (Amersham Pharmacia Công nghệ sinh học) cho một

tổng cộng là 35 mM MgCl2 trong phản ứng, 5,0 ml của một Ngoaøi

thuốc thử chính kịp thời (Albumin huyết thanh bò phi-acetyl hóa

dung dịch nước giải pháp, Sigma B-8667, Trehalose từ Sắc

charomyces cerevisiae, Sigma T-9531, Poly Tween-20

oxethylene Sorbitan Monolaurate, Pierce 28320;

1 M Tris đệm pH 8.0, 16-015Y BioWhitaker) tại 5 ×

tập trung, 2,5 ml của 1,5 mM thăm dò TaqMan

'NHPBPrb (tích hợp DNA Công nghệ), 0,5 ml của

5U ml

-1

Taq ADN polymerase (Promega) và 5 ml

mẫu mẫu DNA.

Phản ứng PCR thời gian thực được ủ ở 94 ° C

300 s tiếp theo là 45 chu kỳ 2-bước khuếch đại

94 ° C cho 5 và 60 ° C trong 30 giây (Giang et al 2003) trên một

Cepheid lọc tự động thông minh (Cepheid). Tất cả các mẫu

nhân rộng hai lần và lỗi có ý nghĩa và tiêu chuẩn của

số lượng bản sao được tính cho mỗi mẫu bằng cách sử dụng

Systat 11 (phần mềm systat).

Các tiêu chuẩn cho real-time PCR là một oligonucleotide

trình tự của 150 bp tương ứng với nucleotide 393

542 trong trình tự gen được công bố của NHPB.

150 bp tiêu chuẩn trình tự (TriLink Biotechnolo-

Gies) bao gồm 144 bp mục tiêu của real-time PCR.

150 bp oligonucleotide là khoảng 99 kdal.

Nhân trọng lượng phân tử bằng cách nghịch đảo của

Avogadro số cho 1,64 × 10-19

g sao chép-1

, 6.1 ×

1018

bản sao g-1

, Và 6,1 × 109

bản sao ng-1

(Tang & ánh sáng-

ner 2001, Whelan et al. 2003). Các oligonucleotide

tiêu chuẩn đã được lưu trữ trong aliquots của 1014

bản sao trong Tris

EDTA đệm, nối tiếp pha loãng trước khi real-time PCR,

và được sử dụng để tạo ra các đường cong tiêu chuẩn.

Để xác định hiện nay biến đổi trong thời gian thực PCR,

bộ nhân rộng các mẫu lồng nhau được đánh giá:

hepatopancreases từ 3 tôm đã được sử dụng để ước tính

khác biệt giữa các hepatopancreases từ khác nhau

tôm, 3 miếng gan tụy mỗi ước tính

sự thay đổi trong một gan tụy, 3 nhổ răng của

mỗi phần gan tụy để ước tính sự thay đổi do

khai thác, và 3 PCR phản ứng của khai thác mỗi

ước tính sự thay đổi do real-time PCR.

Ba cá nhân hiển thị dấu hiệu tổng NHPB

nhiễm trùng đã được gỡ bỏ từ NHPB / Litopenaeus

tôm thẻ chân trắng dài hạn bảo trì hệ thống (Vincent et

al. 2004). Tôm Mỗi đã được cắt ngang tại junc

tion của cephalothorax và bụng và

gan tụy loại bỏ. Mỗi gan tụy

chia thành 3 phần và mỗi phần được đặt trong một

1,5 ml microcentrifuge ống và được lưu trữ ở -20 ° C. Trước khi

khai thác và lọc NHPB DNA, mỗi

mảnh gan tụy được chia thành một mẫu phụ

3 phần nhỏ hơn. Sau khi DNA khai thác mỗi phụ

165Dis Aquat Org 67: 163-169, 2005

mẫu được nhân rộng 3 lần 1:100 pha loãng sau đó

mỗi tái tạo pha loãng đã được phân tích qua thời gian thực

PCR 3 lần.

Các hệ số biến đổi về ngưỡng

chu kỳ của PCR thời gian thực cụ thể cho NHPB ob-

duy trì (1) đối với các mẫu thu được từ tôm,

(2) chiết xuất DNA, (3) để pha loãng của chiết xuất

DNA, và (4) trong pha loãng thay đổi trong thời gian thực

Phản ứng PCR và lô hộp vẽ đồ thị trong systat 11.

KẾT QUẢ

Thời gian khoá học của NHP

NHPB được quan sát thấy trong resorptive (R), sợi nhỏ hợp thành (F)

và vỉ giống như (B) các tế bào ở 6 d tiếp xúc với hậu. Các

ống bị nhiễm bệnh được đặt ở phần gần

của gan tụy, do đó không có phôi thai (E)

các tế bào được quan sát thấy chứa chấp NHPB. Tế bào lần đầu tiên được

quan sát thấy chứa chấp NHPB 19 d tiếp xúc với hậu

gây tử vong nhiễm trùng. 6 d, ống duy nhất rải rác

thường bị nhiễm NHPB. Thông thường, vào đầu năm

NHPB nhiễm trùng, ống lượn bị nhiễm bệnh sẽ được sur-

được làm tròn bằng ống không bị nhiễm bệnh nhiều. Ở tuổi 23 d, NHPB-

ống bị nhiễm bệnh thường bị bao quanh bởi các nhóm

ống bị nhiễm khác.

Từ Ngày 6 Ngày 23, ít hơn 1% của m.

ống topancreatic có NHPB. Sự gia tăng

số lượng các ống có chứa các tế bào bị nhiễm NHPB

xảy ra từ ngày 23 đến 37 khi tỷ lệ

ống bị nhiễm bệnh là 21 đến 85%. Trong tôm experienc

ing NHPB gây ra tử vong, 90 đến 100% của

ống hepatopancreatic bị nhiễm.

Mô học kiểm tra tiết lộ rằng giai đoạn I oc-

curred từ 6 đến 23 d sau phơi nhiễm (Hình 1). Giai đoạn II

được quan sát thấy từ 16 đến 37 d sau phơi nhiễm. Giai đoạn III

xảy ra tại 16 đến 51 d tiếp xúc với hậu và trùng hợp

với tỉ lệ chết và xâm nhập hemocyte và granu

Loma hình thành. Tất cả tôm mà kinh nghiệm NHPB

gây ra tử vong trong giai đoạn III.

Real-time PCR

Một số lượng được biết đến trong số 150 bp NHPB tiêu chuẩn

trình tự đã được sử dụng để tạo ra đường cong chuẩn

(R2

= 0,99) để định lượng NHPB trong hepatopan

creas và phân. Tiêu chuẩn này được nối tiếp pha loãng

chứa từ 1,4 × 108

đến 1,4 × 103

bản sao 5 ml

-1

. Các

giới hạn phát hiện là 10 bản sao của DNA NHPB.

Biến đổi quan sát thấy trong real-time PCR trước

sented trong hình. 2. Hệ số trung bình của sự thay đổi

về chu kỳ ngưỡng cao nhất trong số các ông-

patopancreas mẫu từ tôm khác nhau (0,044).

Hệ số trung bình thấp nhất của biến đổi ob-

phục vụ giữa các phản ứng PCR thời gian thực từ cùng một

bản sao phản ứng ống (0,013).

Real-time PCR cho phép định lượng

NHPB trong quá trình nhiễm trùng (Hình 3). Vào lúc 6 d sau

tiếp xúc, NHPB đã không được phát hiện tại-ông

patopancreas, trong khi nồng độ trung bình của

NHPB trong phân của động vật bị nhiễm bệnh là 10 bản mg-1

.

Vào 16 và 23 d tiếp xúc với bài viết, số lượng trung bình của

NHPB trong các gan tụy là 3,1 × 106

bản sao mg-1

và trong phân 1,9 × 105

bản sao mg-1

. NHPB được tiền

được gửi ở mức 1,2 × 107

bản sao mg-1

gan tụy và

5,2 × 105

bản sao mg-1

phân 37 d tiếp xúc với hậu.

166

Hình 1. Litopenaeus vannamei. Giai Đoạn của NHP quan sát

bệnh giai đoạn I, II, và III trong quá trình nhiễm trùng NHPB.

Giai đoạn I được đánh dấu bằng các ống nằm rải rác với liền kề epi

thelial tế bào có chứa intracytoplasmic NHPB, giai đoạn II bằng cách

tế bào biểu mô kéo đi từ ống lượn và ưa bazơ

tế bào chất có chứa NHPB, và giai đoạn III được đánh dấu bằng

hemocyte xâm nhập, hoại tử ống, melanization, và

fibriosis (Frelier et al 1992)

Hình 2. Litopenaeus vannamei. Hộp-lô của hệ số

biến thể của mẫu gan tụy của tôm khác nhau

(N = 3), 3 miếng gan tụy của mỗi tôm (HP) (n = 9),

3 riêng nhổ từ 3 miếng gan tụy

(N = 27), và ống tương tự sao chép của PCR thời gian thực (n = 81).

Dấu hoa thị biểu thị Bên ngoài; vòng tròn biểu thị xa outlierVincent & Lotz: Khóa học Thời gian của NHP và định lượng vi khuẩn NHP

Có nghĩa là gây chết người tải NHPB được ước tính trong

tôm chết vì nhiễm trùng NHPB là 2,6 × 107

bản sao mg-1

gan tụy và 5,5 × 105

bản sao

mg-1

NHPB đã hiện diện trong phân (Hình 4).

Chẩn đoán nhạy cảm

Mô học, PCR và real-time PCR được sử dụng để-dia

gnose NHPB nhiễm trùng ở vị thành niên Litopenaeus Vanna

mei (Bảng 1). Các bệnh nhiễm trùng đầu tiên đã được phát hiện

mô học và real-time PCR. NHPB nhiễm trong L. van-

namei lần đầu tiên được phát hiện trong gan tụy lúc 6 d

sau khi tiếp xúc trong paraffin nhúng màu mô

một sửa đổi Steiner-Steiner bạc vết từ 33,3%

tôm kiểm tra. Ngoài ra, NHPB de-

được bảo vệ ở số thấp trong phân (10 bản sao mg-1

) Thông qua

thời gian thực PCR tại 6 d tiếp xúc với hậu, trong khi nó lần đầu tiên

phát hiện bằng phương pháp PCR tại 16 d tiếp xúc-bài-ông

patopancreas và phân. 23 d tiếp xúc với hậu, histol

ogy và real-time PCR phát hiện một giai đoạn NHPB sớm I

nhiễm trùng. Quan sát giá trị của chẩn đoán dương tính NHPB

thông qua các phương pháp khác nhau không thống kê khác nhau

bằng cách sử dụng thử nghiệm chính xác Fisher (định lượng Ký sinh trùng 2.0,

Rozsa et al. 2000), mặc dù có sự khác biệt có thể được

khó phát hiện do các tần số thấp của tích cực

mẫu. Tất cả những con đã thử nghiệm âm tính NHPB

thông qua mô học, PCR và real-time PCR.

THẢO LUẬN

NHP-vi khuẩn nhiễm vào các tế bào hepatopancreatic.

Gan tụy là tuyến tiêu hóa lớn và

có chứa một số loại tế bào bao gồm E, R, F và B-tế bào

(Gibson & Barker 1979). E-tế bào đặc trưng bởi

hoạt động phân bào là nguồn gốc của các loại tế bào khác

và được đặt ở phần xa nhất của

gan tụy (Vogt 1994). Các loại phong phú nhất,

R-tế bào, lưu trữ chất béo và glycogen, ít nhất là phong phú

loại, F-tế bào, chức năng bài tiết enzyme và tế bào B

chức năng tiêu hóa nội bào, chất dinh dưỡng accumula

tion, và vận chuyển vật liệu tiêu hóa (Al-Mohanna

- Nott 1986, 1987).

Ít được biết đến của các cơ chế của bệnh sinh của

NHPB. Tuy nhiên, chúng tôi quan sát thấy tăng số lượng

hepatopancreatic tế bào có chứa NHPB trong

quá trình nhiễm trùng, cho thấy vi khuẩn multiplica

tion và lan truyền được kết hợp với mô tăng

thiệt hại. Ngoài ra, tất cả đều trưởng thành, nhưng không phải là chưa trưởng thành,

hepatopancreatic loại tế bào được quan sát bến cảng

NHPB trong bệnh nhiễm trùng đầu. Sự xuất hiện của NHPB trong

loại tế bào trưởng thành trong thời gian nhiễm đầu cho thấy không có

167

Phân gan tụy tôm ngày

ID Mô học PCR Real-time PCR thời gian thực

PCR PCR

6 115 + - - - +

6 145 + - - - +

16 108 + + + - +

16 120 + + + + +

23 67 + - + - -

23 171 + + + + +

23 217 + + + + +

37 15 + + + + +

37 125 + + + + +

Bảng 1. Litopenaeus vannamei. So sánh các mô học

và các phương pháp phân tử để chẩn đoán của NHPB cá nhân

tôm gan tụy và phân trong quá trình NHPB

nhiễm trùng. +: NHPB kết quả tích cực; -: NHPB kết quả âm tính.

Sáu tôm tiếp xúc với mỗi hệ điều hành để mô nhiễm NHPB đã chạy

domly loại bỏ khoảng thời gian 3, 6, 9, 16, 23, 30, 37, 44,

và 53 d sau phơi nhiễm

Hình 3. Litopenaeus vannamei. Real-time PCR định lượng

NHPB mg-1

gan tụy và phân trong thực nghiệm

kiểm đếm bị nhiễm bệnh tôm một cách ngẫu nhiên loại bỏ trong khoảng thời gian

3, 6, 9, 16, 23, 30, 37, 44, và 53 d sau NHPB-tiếp xúc

Hình 4. Litopenaeus vannamei. Real-time PCR định lượng

NHPB gây chết người tải mg-1

gan tụy và phân

trong tôm bị nhiễm bệnh thực nghiệm trải qua NHPB

gây ra mortalityDis Aquat Org 67: 163-169, 2005

ưu đãi đặc biệt cho các tế bào trưởng thành để phát triển

bị nhiễm trùng. Tuy nhiên, việc thiếu NHPB phát hiện trong

E-tế bào cho thấy rằng họ có thể không phù hợp cho

nhiễm trùng như các loại tế bào khác.

Gan tụy, chỉ trang web của NHPB

nhiễm trùng, và phân là những vật liệu tôm chỉ

hiện nay được sử dụng để chẩn đoán nhiễm trùng NHPB. Các

chẩn đoán nhiễm trùng NHPB thông qua phân tử hoặc

thử nghiệm mô học của mô gan tụy yêu cầu

giết chết các động vật bị nghi ngờ chở NHPB nhiễm

tion, trong khi một phương pháp không phá hủy của NHPB chẩn

nosis trong phân của bố mẹ sống Litopenaeus vannamei

đã được báo cáo bởi Briñez et al. (2003). Ngoài ra, chúng

phát hiện DNA NHPB trong phân của tôm vị thành niên sống.

Sự hiện diện của NHPB DNA trong phân chỉ ra rằng

vi khuẩn được đổ ra từ động vật sống vào các ao môi

trường và đó phân có thể là nguồn lây truyền

NHPB, mặc dù ăn thịt người chết và chết

NHPB tôm bị nhiễm bệnh là có thể là một nguồn tự nhiên mới

NHPB nhiễm trùng (Vincent et al 2004). Phân tích của phân

mẫu để chẩn đoán nhiễm trùng NHPB có thể được Applic

có thể khi kiểm tra đắt tiền bố mẹ, nhưng đã

giới hạn ứng dụng trong một môi trường trang trại nuôi tôm

nơi lấy mẫu vị thành niên vài NHPB thích hợp

chẩn đoán sẽ không ảnh hưởng đến sản xuất tổng thể.

Bởi vì không có khả năng văn hóa NHPB bởi traditio

phương pháp nal vi khuẩn, đã có không previ

độc hại xác định tải NHPB ở động vật bị nhiễm bệnh.

Tuy nhiên, PCR thời gian thực cho phép định lượng này.

unculturable vi khuẩn. Chúng tôi ước tính số lượng

NHPB Hiện nay trong cả hai gan tụy và phân của trong-

fected tôm trong quá trình nhiễm trùng NHPB. Các

cao nhất NHPB tải là 8,9 × 107

vi khuẩn mg-1

của m.

topancreas quan sát thấy trong một nhiễm trùng gây chết người. Số tiền

NHPB Hiện nay trong gan tụy cao hơn

quan sát thấy trong phân của cùng một cá nhân.

Bệnh giai đoạn NHP theo phân loại Frelier et

al. (1992) tiến triển trong quá trình nhiễm trùng.

Thông qua phân tích mô học, giai đoạn I và II

quan sát thấy trong tôm hiển thị không có dấu hiệu công khai của NHP

bệnh. Tuy nhiên, giai đoạn III NHP bệnh đã được quan sát

cá nhân hiển thị dấu hiệu tổng NHPB nhiễm

tion. Ngoài ra, tất cả các tôm có kinh nghiệm NHPB

gây ra tử vong trong NHP bệnh giai đoạn III.

NHPB lần đầu tiên được phát hiện 6 d sau phơi nhiễm, 10 d

trước khi quan sát thấy tỷ lệ tử vong. Một mg 25 phụ mẫu của

gan tụy đã được cắt bỏ và kiểm tra bằng phương pháp PCR,

trong khi đó gan tụy còn lại đã được cố định

phân tích mô học. Điều này phụ mẫu là xấp

xỉ một phần mười của tổng số gan tụy. Có-

mũi, sự thất bại để chẩn đoán NHPB trong nhiễm trùng sớm

hơn 16 d-tiếp xúc thông qua PCR có thể là một yếu tố

của các tiểu lấy mẫu mô để xét nghiệm chẩn đoán nhiều. Trong

Ngoài ra, sự xuất hiện của độ nhạy cao hơn trong thực

time PCR phân tích phân trên mô gan tụy

có thể là do phân (250 mg) đang được thử nghiệm

hơn so với gan tụy (25 mg) trong các phân tích phân tử.

Trong thời gian phân tích khóa học của NHPB, sự vắng mặt của

NHPB tích cực động vật 30 d tiếp xúc sau có thể là các

kết quả của tỷ lệ tử vong NHPB. Tỉ lệ chết từ NHPB

quan sát thấy từ 16 đến 51 d tiếp xúc với hậu với một đỉnh cao

34 d. Do đó,% tôm dương tính NHPB

giảm theo thời gian do mất tỷ lệ tử vong. Nhìn chung, chỉ có

1 / 4 của các cá nhân tiếp xúc NHPB nhiễm

vật liệu đã được chẩn đoán là NHPB dương tính, và điều này

% của động vật mắc bệnh thấp có thể là do

liều (Vincent et al 2004).

Các nhạy cảm khác nhau của các phương pháp chẩn đoán

phát hiện các nhiễm trùng NHPB trước khi khởi phát

tỷ lệ tử vong cho thấy sự cần thiết phải sử dụng nhiều

phương pháp chẩn đoán cho chẩn đoán thích hợp trong

môi trường ao nuôi tôm. Sự phát triển của

PCR thủ tục cụ thể thời gian thực cho NHPB tạo ra op-

portunities để kiểm tra tác động liều NHPB ban đầu

truyền tải và tỷ lệ tử vong của các cá nhân bị nhiễm bệnh.

Lời cảm ơn. Các tác giả cảm ơn V. Breland và M.

Turner cho hỗ trợ kỹ thuật, và đánh giá 3 vô danh

ers cho ý kiến ​​về bản thảo. Nghiên cứu này

một phần được tài trợ bởi Hoa Kỳ Sở

Nông nghiệp, CSREES Grant Số 2002-38808-01381.

TÀI LIỆU trích dẫn

Al-Mohanna SY, Nott JA (1986) tế bào B và tiêu hóa trong

gan tụy của Penaeus semisulcatus (giáp xác:

Decapoda). J Mar Biol PGS Anh 66:403-414

Al-Mohanna SY, Nott JA (1987) R-tế bào và chu trình tiêu hóa trong

Penaeus semisulcatus (giáp xác: Decapoda). Mar Biol 95:

129-137

Bradley-Dunlop DJ, Pantoja C, Lightner DV (2004) Phát triển-

của kháng thể đơn dòng phát hiện Necrotiz

ing Hepatopancreatitis tôm penaeid. Dis Aquat Org

60:233-240

Briñez B, Aranguren F, Salazar M (2003) phân mẫu

Nguồn DNA cho việc chẩn đoán hoại tử gan

viêm tụy (NHP) ở tôm thẻ chân trắng Penaeus bố mẹ. Dis

Aquat Org 55:69-72

Frelier PF, Sis RF, Bell TA, DH Lewis (1992) kính hiển vi và

siêu nghiên cứu về Hepatopancreatitis hoại tử

ở Thái Bình Dương tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi trong

Texas. Vet Pathol 29:269-277

Gibson R, Barker PL (1979) gan tụy loại thập túc.

Oceanogr Mar Biol Annu Rev 17:285-346

Giang J, Temenak JJ, Richards AL (2003)-Time PCR

duplex khảo nghiệm đối với Rickettsia prowazekii và Borrelia tái phát

rentis. Ann N Y Acad Khoa học 990:302-310

Johnson SK (1990) Sổ tay của bệnh tôm. Tex A & M

Đại học biển Grant Sb TAMU-SG-90-601, College Station,

TX

Krol RM, Hawkins CHÚNG TÔI, Overstreet RM Rickettsial (1991) và

mollicute nhiễm trùng trong các tế bào hepatopancreatic của văn hóa

Thái Bình Dương tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). J Invertebr

Pathol 57:362-370

Lightner DV (1996) Một cuốn sổ tay của bệnh lý và chẩn đoán

168Vincent Lotz: Thời gian khoá học của NHP và định lượng vi khuẩn NHP

thủ tục cho bệnh của tôm penaeid. Sở

Khoa Học Thú Y, Đại học Arizona, Tucson, AZ

Lightner DV, RM Redman (1994) Một bịnh dịch thú của hoại tử

Hepatopancreatitis trong nuôi tôm penaeid (crus-

tacea: Decapoda) ở tây bắc Peru. Nuôi trồng thủy sản 122:

18/09

Lightner DV, RM Redman, Bonami JR (1992) hình thái

bằng chứng về một nguyên nhân vi khuẩn duy nhất ở Texas Necrotiz

ing Hepatopancreatitis Penaeus tôm thẻ chân trắng (giáp xác:

Decapoda). Dis Aquat Org 13:235-239

Lotz JM, Hoa AM, Breland V (2003) Một mô hình của Taura

Hội chứng virus (TSV) bệnh dịch Litopenaeus van

namei. J Invertebr Pathol 83:168-176

Loy JK, Frelier PF (1996) cụ thể, nonradioactive phát hiện

vi khuẩn NHP Penaeus tôm thẻ chân trắng tại chỗ

lai tạo. J Vet Diagn Đầu tư 8:324-331

Loy JK, Frelier PF, P Varner, Templeton JW (1996a) phát hiện

của tác nhân bệnh nguyên của Hepatopancreatitis hoại tử

nuôi tôm thẻ chân trắng Penaeus từ Texas và Peru bởi poly-

merase chuỗi phản ứng. Dis Aquat Org 25:117-122

Loy JK, Dewhirst FE, Weber W, Frelier PF, Garbar TL, Tasca

SI, JW Templeton (1996b) phát sinh học phân tử và trong

phát hiện tại chỗ của các tác nhân bệnh nguyên của hoại tử

Hepatopancreatitis trong tôm. Appl môi trường Microbiol 62:

3439-3445

Pruder, GD, Brown CL, chứng gầy mòn bắp thịt ngựa JN, Carr WH (1995)

hệ thống y tế tôm: cung cấp hạt giống - lý thuyết và thực hành.

Trong Browdy, C.L. và Hopkins, J.S. (Eds). Bơi

thông qua nước gặp khó khăn. Proc Spec sess Nuôi tôm.

Thế giới Nuôi trồng thủy sản Hiệp hội, Baton Rouge, LA, p 40-52

Rozsa L, Reiczigel J, G Majoros (2000) Định lượng ký sinh trùng

trong các mẫu của máy chủ. J Parasitol 86:228-232

Tang KFJ, Lightner DV (2001) phát hiện và định lượng

hypodermal truyền nhiễm và virus trong máu hoại tử

penaeid tôm bằng PCR thời gian thực. Dis Aquat Org 44:

79-85

Varner PW (1998) hoại tử Hepatopancreatitis: xác nhận

một phát hiện khảo nghiệm PCR dựa trên môi trường để sử dụng trong

mô tả dịch tễ học nghiên cứu. Luận án tiến sĩ, Texas

A & M University, College Station, TX

Vincent AG, Breland VM, Lotz JM (2004) thực nghiệm nhiễm

tion của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương Litopenaeus tôm thẻ chân trắng với

hepatopancreatitis hoại tử (NHP) vi khuẩn bằng cách mỗi os

tiếp xúc. Dis Aquat Org 61:227-233

Vogt G (1994) trong chu kỳ sản và chức năng tế bào học của

tế bào hepatopancreatic Astacus astacus (giáp xác,

Decapoda). Zoomorphology 114:83-101

Whelan JA, Russell NB, Whelan MA (2003) Một phương pháp cho

xác định số lượng tuyệt đối của cDNA bằng cách sử dụng real-time PCR.

Phương pháp Immunol J 278:261-269

169

Biên tập chịu trách nhiệm: Timothy Flegel,

Bangkok, Thái Lan

Nộp: 02 tháng ba năm 2005; Chấp nhận: ngày 04 tháng 5 năm 2005

Bằng chứng nhận được từ tác giả (s): 30 Tháng 9, 2005