ỨNG DỤNG VÀ MÔI TRƯỜNG vi sinh, năm 1996 tháng chín, p. 3439-3445 Vol. 62, số 9

0099-2240/96 / $ 04.0010

Copyright q 1996, American Hiệp hội Vi sinh vật

Phát sinh học phân tử và phát hiện Situ của bệnh nguyên

Đại lý của Hepatopancreatitis hoại tử ở tôm

James K. Loy,

1

* Floyd E. DEWHIRST

2

WILLIAM Weber,

3

Paul F. FRELIER,

1

Theodore L. GARBAR,

1

SERBAN I. TASCA,

1

Và JOE W. Templeton 1

Cục Thú y Pathobiology, Texas A & M University, College Station, Texas 778431

Cục Di truyền học phân tử, Trung tâm Nha khoa Forsyth, Boston, Massachusetts 021152

và Aprogenex, Inc, Houston, Texas 770543

Nhận được 27 tháng Chín 1995/Accepted 05 tháng sáu năm 1996

Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) là một bệnh nghiêm trọng của nuôi trồng Penaeus vannamei đã được

liên quan với thiệt hại tử vong từ 20 đến 95%. NHP lần đầu tiên được công nhận tại Texas vào năm 1985 (S. K.

Johnson, p. 16, trong Sổ tay bệnh tôm, 1989) và là một căn bệnh kinh tế quan trọng đã hạn chế

khả năng để nuôi tôm ở Texas. Nguyên nhân giả định của NHP là một gram âm, pleomorphic, intracel

lular, rickettsia giống như vi khuẩn vẫn còn vô văn một phần vì sự vắng mặt của tôm thành lập

tế bào dòng. Không có khả năng vi khuẩn NHP văn hóa đòi hỏi phải sử dụng các phương pháp phân tử-phyloge

netic vị trí của vi khuẩn NHP. Các gen mã hóa 16S rRNA (16S rDNA) của tác nhân gây bệnh tôm

đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR, nhân bản, và giải trình tự. Phân tích trình tự nhân bản 16S rDNA chỉ ra rằng

NHP vi khuẩn là một thành viên của lớp con của Proteobacteria. Trong lớp con alpha, NHP

vi khuẩn được thể hiện chặt chẽ nhất có liên quan đến các endosymbionts vi khuẩn nguyên sinh động vật, Caedibacter caryophila

và Holospora obtusa. Ngoài ra, các vi khuẩn NHP là khác biệt nhưng có liên quan đến các thành viên của nhóm sốt phát ban

(Rickettsia typhi và R. prowazekii) và nhóm phát hiện sốt (R. rickettsii) của Rickettsiaceae gia đình. Fluores-

cently dán nhãn thiết bị thăm dò DNA oligonucleotide liên kết với vùng biến đổi (V2, động cơ V6 và V8) 16S rRNA của

NHP vi khuẩn đã được sử dụng để phát hiện vi khuẩn trong tôm bị nhiễm bệnh bằng cách lai tạo tại chỗ. Kỹ thuật này

cung cấp bằng chứng trực tiếp hình ảnh các 16S rDNA được khuếch đại, nhân bản, và trình tự đã được bắt nguồn từ

vi khuẩn nội bào, nhiễm vào gan tụy của tôm nuôi trồng tôm thẻ chân trắng P..

Một loại vi khuẩn nội bào cuốn tiểu thuyết có liên quan với một nghiêm trọng

bệnh của trang trại, nâng lên Thái Bình Dương tôm thẻ chân trắng, Penaeus vannamei.

Căn bệnh này là phổ biến nhất được gọi là hoại tử m.

topancreatitis (NHP), tuy nhiên, từ đồng nghĩa cho NHP

Texas ao hội chứng tử vong và u hạt gan-

viêm tụy (14, 24). NHP là kinh tế quan trọng dis-

dễ dàng bị hạn chế sản xuất tôm ở Texas và

gần đây đã được chẩn đoán ở Trung và Nam Mỹ.

Nguyên nhân giả định của NHP là một gram âm, pleomorphic,

nội bào, rickettsia giống như loại vi khuẩn cư trú và đa

Minh Tuyet trong ống tế bào biểu mô của gan tụy của trong-

fected tôm.

Nghiên cứu hình thái của NHP mô tả hai hoặc ba khác biệt

hình thức vi khuẩn trong các tế bào chất của bị nhiễm hepatopancre-

ATIC hình ống biểu mô tế bào (14, 21, 24). Mặc dù nhiều

sinh vật hình thái khác biệt có liên quan

NHP, những sinh vật này được cho là đại diện khác nhau mor

phologic hình thức của một loại vi khuẩn phức tạp, (24). Nhất

hình thức phổ biến của vi khuẩn NHP là một, nhỏ pleomorphic,

coccobacillus gram âm hình thái tương tự như

thành viên của các Rickettsiales thứ tự. Hình thức này của vi khuẩn

là vòng (trung bình 0,32 mm đường kính) để que hình và

trưng bày một trilaminar màng tế bào chất với một undulat

ing, bên ngoài phong bì. Các hình thức vi khuẩn hình que là

Dài từ 0,59 đến 1,18 mm và rộng 0,36 mm. Đôi khi, que

hình thức vi khuẩn hình thể hiện một hình khuyên ngang, tập trung

co thắt, chỉ ra rằng hình thức này sao chép nhị phân FIS-

sion (14). Hình thái khác biệt hình thức các bacte

rium là một thanh xoắn ốc dài trưng bày một hồ sơ giảm dần

các đường lằn xoắn ốc nổi bật ở cực đỉnh và lu-nhiều

% không bào trong các khía cạnh mài mòn đáy, của sinh vật.

Điều này ít phổ biến hơn, dạng xoắn ốc của các vi khuẩn NHP chứa

tám, dài periplasmic roi phát sinh từ các khía cạnh đáy

của sinh vật chưa được xác định trong replicative

hình thức (24). Dạng xoắn ốc của các vi khuẩn trung bình NHP

0,24 mm chiều rộng và có thể vượt quá 3,25 mm chiều dài (14, 21, 24).

An, hình thức trung gian không rõ ràng rằng cuộc triển lãm hình thái

đặc điểm chung để replicative của cả hai và xoắn ốc

các hình thức đôi khi được xác định trong hepatopancreatic nhiễm

biểu mô tế bào. Đây là hình thức trung gian là một thanh kéo dài

hình sinh vật trưng bày một cong hồ sơ cá nhân nhấp nhô

và chứa số lượng khác nhau của không bào chất nguyên sinh lucent

tập trung ở một đầu của sinh vật. Progressive

thay đổi hình thái trong các hình thức trung gian cho một mat-

uration trình tự từ hình thức replicative về phía xoắn ốc

hình thức. Trong thời gian này biến thái, hình thức trung gian ac

quires một hồ sơ giảm dần với một khía cạnh riêng biệt đáy mài mòn

và một khía cạnh đỉnh nhọn (24).

Những nỗ lực văn hóa vi khuẩn NHP được unsuc

cessful, một phần vì sự vắng mặt của tôm thành lập

hệ thống nuôi cấy tế bào (13). Tuy nhiên, dạng hình que của

NHP vi khuẩn đã được tinh chế bởi mật độ Percoll dốc

ultracentrifugation và NHP đã được sao chép bằng cách tiêm

của vi khuẩn làm giàu cô lập vào gan tụy

tôm P. vannamei bình thường. Tái sản xuất thử nghiệm này

NHP phục vụ để chứng minh rằng vi khuẩn nội bào là

tác nhân gây bệnh của NHP và chỉ ra rằng hình que

hình thức vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong tác nhân gây bệnh

esis của bệnh (14).

Này rickettsia như NHP vi khuẩn vẫn còn vô văn,

và phân loại phân loại của nó là không chắc chắn. Các hệ thống

* Tương ứng với tác giả. Địa chỉ hiện: Sở thí nghiệm

Bệnh học, Bristol-Myers Squibb, P.O. Box 4000, F14-03, Princeton, NJ

08543. Điện thoại: (609) 252-5071. Fax: (609) 252-6609.

3439evaluation của chuỗi acid nucleic đã cho phép, phí xây dựng

tion các đề án phát sinh loài cho prokaryote đa dạng và eu-

karyotic sinh vật (10, 12). Trình tự 16S rRNA và

gen mã hóa 16S rRNA (16S rDNA) được sử dụng cho

phát sinh loài phân loại vi khuẩn (7, 8, 26, 27, 42) và

đặc biệt hữu ích trong việc phân loại phân loại của vô văn

hoặc các vi khuẩn khó tính (20, 30, 38, 41). Các tiện ích của các ribo

somal tiểu đơn vị để phân loại phát sinh loài dựa trên của nó

phân phối phổ quát, tính thống nhất của chức năng, bảo tồn pri

mary liên tục với tốc độ thấp của sự thay đổi, và dễ bị cô lập

(12). Trong nghiên cứu này, các 16S rDNA của một Percoll-tinh khiết cô lập

của vi khuẩn NHP đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR, nhân bản vô tính thành một

pSP65 vector, và trình tự để cho phép phát sinh loài classifi

cation của vi khuẩn NHP.

Trong lai tạo tại chỗ với đầu dò huỳnh quang oligonucleotide

đã được sử dụng để cung cấp phân loại phát sinh loài của vi khuẩn

và có thể được sử dụng để phân biệt các loài vi khuẩn trong liên quan

nhóm di truyền (2-4, 6, 35). Trong nghiên cứu này, các NHP

vi khuẩn đã được xác nhận là nguồn gốc của những khuếch đại,

nhân bản vô tính, và trình tự 16S rDNA lai tại chỗ. Các

16S rDNA trình tự thu được trong quá trình phát sinh loài classifica

tion của vi khuẩn NHP được phân tích và cụ thể oligonu,

cleotide đầu dò được thiết kế để lai giống với các khu vực biến (V2,

V6 và V8) 16S rRNA của vi khuẩn NHP

xác định và thử nghiệm. Lai tạo tại chỗ cho thấy fluoro-

oligonucleotide chrome nhãn hiệu thiết bị thăm dò địa hoá đến các cyto

vết bùn của hepatopancreatic tế bào biểu mô ống của NHP-

tôm thẻ chân trắng nhiễm P. tôm, do đó chứng thực các NHP

vi khuẩn như là nguồn gốc của chuỗi 16S rDNA.

TÀI LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vi khuẩn phân lập và khai thác DNA của vi khuẩn. Các dạng hình que của

NHP vi khuẩn được phân lập từ hepatopancreata tôm thu được trong một

tự phát bùng nổ của NHP P. nuôi tôm thẻ chân trắng ở Texas. Các NHP

vi khuẩn đã được tinh chế từ các mô tôm Percoll sửa đổi (Pharmacia

LKB, Pleasant Hill, California) mật độ dốc ly tâm như mô tả previ

ously (13, 37). Tóm lại, 8-10 hepatopancreata ướp lạnh đã được tẩm ướt và

ly tâm ở g 3 200 cho 8 phút trong bộ đệm Tris-sucrose (pH 7.4), có chứa 0,033

Tris M-hydrochloride 0,25 M và sucrose, để loại bỏ các mảnh vỡ mô. Siêu

natant đã được gỡ bỏ, lớp trên Percoll ở một nồng độ cuối cùng 40%, và

ly tâm ở g 3 25.000 cho 60 phút trong một ultracentrifuge. Một ban nhạc của vi khuẩn,

được hình thành tại giao diện của Percoll, thu hoạch và đông lạnh trong aliquots

2708C. Smears của ban nhạc thu hoạch được nhuộm màu Gram vết bẩn, và một viên

bắt nguồn từ các ban nhạc thu hoạch đã được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử để con-

công ty có sự hiện diện của vi khuẩn NHP (13). DNA được chiết xuất từ ​​hai

riêng biệt Percoll chủng vi khuẩn NHP tinh khiết. Tóm lại, 25 mg

Percoll-tinh khiết vi khuẩn cô lập được lơ lửng trong 250 ml dung dịch đệm tiêu hóa (50

mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% sodium dodecyl sulfate [pH 8,5]) trong 0,5 ml

Eppendorf ống. Proteinase K (7,5 ml của một giải pháp chứng khoán 20-mg/ml) đã được bổ sung

mỗi ống, và giải pháp đã được ủ ở 608C trong 2 giờ với định kỳ

vortexing chất phản ứng, điều này đã được theo sau bởi bất hoạt nhiệt của proteinase K

958C cho 10 phút. Các ống này sau đó được microcentrifuged trong 3 phút ở 13.000 rpm,

và 75 ml của bề được áp dụng cho một SPIN Chroma TE-100 (Clon

công nghệ phòng thí nghiệm, Palo Alto, California) cột và ly tâm trong một cánh quạt ngang

theo quy định của nhà sản xuất. Eluent thu thập bằng cách ly tâm

pha loãng 1:100 và 1:1,000 trong nước cất (Gibco BRL, Grand Island, NY)

trước khi sử dụng trong khuếch đại PCR của 16S rDNA.

PCR. 16S rDNA của vi khuẩn NHP đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR với nhẹ

sửa đổi của mồi được mô tả bởi Weisburg et al. (38). Các mồi

được thiết kế để nhắm mục tiêu rDNA 16S với bản sao gần như đầy đủ độ dài của 16S

rDNA (khoảng 1.500 cơ sở). Các PCR mồi 59 và 39 kết hợp một

HindIII hạn chế trang web và một trang web hạn chế EcoRI, tương ứng, để tạo điều kiện

chèn vào một vector nhân bản plasmid. Trình tự của mồi về phía trước

59GCAAGCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCA (Escherichia coli vị trí từ 8 đến

26), và trình tự của mồi ngược lại là 59GCGAATTCACGGCTACC

TTG TTACGACTT (vị trí E. coli 1492-1512). Hạn chế HindIII trang web

mồi về phía trước và các trang web hạn chế EcoRI trong mồi ngược lại là

gạch chân. PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng 50-ml có chứa 10 mm

Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl, 200 deoxynucleotides mM, 0,5

mM (mỗi) về phía trước và cặp mồi ngược lại, 1,25 U AmpliTaq DNA

polymerase (Perkin-Elmer Cetus Instruments, Norwalk, bang Connecticut), và từ 0,03 đến 0,3

mg DNA mẫu (2,5 ml của DNA tinh khiết cột trước đó pha loãng

1:100 hoặc 1:1,000 trong nước cất). Các giải pháp cuối cùng sau đó đã được che phủ với

dầu khoáng. Hồ sơ cá nhân khuếch đại bao gồm 30 chu kỳ 45 s ở 928C, 45 s

ở 528C, and2mat728C với thêm 8 phút ở 728C sau trận chung kết

chu kỳ. Một số chia hết một số 10 ml của mỗi sản phẩm PCR đã được kiểm tra bằng điện di trong

1% agarose trong Tris-acetate-EDTA (TAE) đệm có chứa 1 mg của ethidium

bromide mỗi ml.

Nhân bản và sắp xếp các sản phẩm PCR. Các sản phẩm PCR được tinh chế bằng

điện di (50 V từ 5 đến 6 giờ) trong một gel agarose 1,5% để loại bỏ

chưa được sơn lót và các sản phẩm mở rộng chưa đầy đủ của PCR. Sau

điện di, các ban nhạc có chứa sản phẩm PCR được cắt bỏ từ các Aga

tăng gel và DNA được chiết xuất từ ​​các ma trận gel gel với DNA Qiaex

bộ dụng cụ khai thác, theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Qiagen, Studio City, Cal-

.). Các sản phẩm PCR được sau đó được ủ với HindIII và EcoRI

(Boehringer Mannheim) theo khuyến cáo của nhà sản xuất và ligated đến một

tương tự như chuẩn bị pSP65 vector (Promega, Madison, Wisconsin) để chuẩn bị cho

nhân bản trong Epicuran coli SCS1 tế bào có thẩm quyền (Stratagene, La Jolla, California).

Sau chuyển đổi và lựa chọn các dòng vô tính, các plasmid được chiết xuất từ

chuyển đổi các tế bào với P20 cột (Qiagen, Chatsworth, California) như khuyến cáo

vá của nhà sản xuất và resuspended trong 100 ml dung dịch đệm TE. Các

plasmid đã được sàng lọc chèn PCR HindIII và tiêu hóa EcoRI của một

2-ml phần nhỏ của mỗi giải pháp plasmid tiếp bằng điện di gel agarose của

sản phẩm. Mười plasmid nhân bản vô tính có chứa một chèn kích thước thích hợp

theo dõi chấm dứt chuỗi trình tự DNA với DNA bộ Sequenase

(Hoa Kỳ Sinh hóa, Cleveland, Ohio) theo khuyến cáo của các manu

facturer. Ban đầu, 200 cơ sở đầu tiên của mỗi sợi DNA từ chèn của 10

nhân bản đã được sắp xếp theo trình tự, và không có bất xứng hợp đã được xác định.Bảy nhân bản

bắt nguồn từ một mẫu vi khuẩn, và ba nhân bản được lấy từ

mẫu vi khuẩn khác. Kể từ khi 200 cơ sở đầu tiên của một trong hai sợi của 16S rDNA

bao gồm công nhận các khu vực thay đổi, các dòng vô tính được coi là tương đương.

Sau đó, sáu dòng vô tính đã được lựa chọn và trình tự hoàn toàn. Chuỗi

mồi và vị trí gần đúng của họ trong các 16S rDNA (số E. coli)

được liệt kê trong Bảng 1.

16S rRNA phân tích dữ liệu. 16S rDNA trình tự được so sánh với tất cả các

Các chuỗi dữ liệu được duy trì trong cơ sở dữ liệu GenBank và EMBL bằng cách sử dụng

BLAST thuật toán để đảm bảo rằng nguồn gốc của trình tự 16S rDNA và

rằng trình tự là độc đáo (1). Đối với phân tích phát sinh loài, một chương trình thiết lập cho

nhập dữ liệu, chỉnh sửa, trình tự liên kết, trung-cấu trúc so sánh, Simi

thế hệ larity ma trận, và xây dựng dendrogram cho 16S rRNA dữ liệu

bằng văn bản trong Microsoft QuickBasic cho sử dụng trên máy tính IBM và các máy tính tương thích

(28). Cơ sở dữ liệu trình tự có chứa khoảng 500 chuỗi xác định

trong phòng thí nghiệm của FE Dewhirst và 200 thu được từ GenBank hoặc

Dự án Cơ sở dữ liệu ribosome (7, 8, 28). Ma trận tương tự đã được xây dựng

từ các chuỗi liên kết bằng cách chỉ sử dụng các vị trí đó 90% các chủng

có dữ liệu. Ma trận tương tự đã được sửa chữa cho nhiều thay đổi cơ sở

phương pháp Jukes và Cantor (18). Cây phát sinh loài đã được xây dựng bởi

người hàng xóm tham gia phương pháp của Saitou và Nei (31). Bootstrapping của hàng xóm

BẢNG 1. Trình tự mồi và địa điểm gần đúng trong

16S rRNA chuỗi các E. coli

Primer

tên

Primer

trình tự

Vị trí

(E. coli)

Primer 1187 59 TCACACAGGAAACAGCTATG-39

FS-1 59-GACGATAATGACGGTAGCAG-39 474-499

FS-2 59 GGAGCAAACAGGTTAGA-39 775-792

FS-3 59 GGGACAGAAGGCTCAG-39 998-1014

FS-4 59 CTTATGGGCTGGGCTACACA-39 1011-1029

Primer 59-ATTTAGGTGACACTATA-39

rs-1 59-TGTGTAGCCCAGCCCATAAG-39 1211-1228

rs-2 59 CATCGTTTACGGCGTGGA-39 807-820

rs-3 59 GGGCTTTCACACCTTGCTTA-39 613-595

rs-4 59 CTACCGTCATTATCGTCACA-39 445-459

rs-5 59 AGGTAGATTCCCGTGTATTA-39 119-138

một

Trình tự mồi trong vector nhân bản.

BẢNG 2. Trình tự của các đầu dò huỳnh quang-dán nhãn

một

Thăm dò

tên

Thăm dò chuỗi

Vị trí

(E. coli)

prV2 59-AGGTAGATTCCCGTGTATTA-39 151-171

prV6 59-TCTGATGCCTCCTGTCCCTAT-39 997-1018

prV8 59-TCACCCCCTTGCTTCTCATTGT-39 1249-1271

NS 59-ATTCCTTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTT-39 338-367

một

Vị trí gần đúng của mỗi đầu dò (với số lượng E. coli) là được.

3440 Loy ET AL. APPL.ENVIRON.MICROBIOL.TABLE 3. Ma trận tương tự dựa trên 16S rRNA so sánh chuỗi

Loài

% Tương tự% differencea

Afipia felis

Beijerinckia indica

Brucella abortus

Bartonella Quintana

Agrobacterium tumefaciens

Rhodobacter capsulatus

Rhodobacter sphaeroides

Hyphomonas jannaschiana

Erythrobacter longus

Sphingomonas capsulata

Sphingomonas paucimobilis

Azospirillum lipoferum

Magnetospirillum magnetotacticum

Rhodospirillum rubrum

Anaplasma marginale

Cowdria ruminantium

Wolbachia pipientis

Ehrlichia sennetsu

Rickettsia typhi

Rickettsia prowazekii

Rickettsia rickettsii

NHP vi khuẩn

Caedibacter caryophila

Holospora obtusa

Piscirickettsia salmonis

NIX vi khuẩn

Coxiella burnetii

Escherichia coli

Afipia felis 92,2 89,6 88,6 88,8 85,8 88,0 86,8 85,9 85,3 86,0 87,5 87,0 86,4 81,8 81,2 81,0 80,4 83,1 83,2 83,0 82,9 85,6 84,0 80,9 80,8 82,0 79,6

Beijerinckia indica 8,2 90,2 89,7 90,3 88,1 89,2 88,1 86,0 86,5 86,4 88,8 87,5 86,2 81,8 82,1 81,1 80,6 83,7 83,5 83,4 82,8 85,4 83,0 80,9 81,0 81,4 79,6

Brucella abortus 11,2 10,5 94,1 93,5 89,2 89,3 89,4 87,8 88,7 87,2 87,9 86,9 87,2 82,5 82,3 82,1 81,7 84,3 84,2 84,3 82,6 86,2 84,0 82,1 81,6 81,7 80,6

Bartonella Quintana 12,3 11,1 6,1 92,8 87,9 87,9 88,1 87,0 87,4 85,8 87,4 86,5 86,3 83,0 82,9 82,3 80,9 84,7 84,5 84,7 82,3 86,2 82,7 82,2 82,9 81,7 79,7

Agrobacterium tumefaciens 12,1 10,4 6,8 7,5 87,5 88,2 87,3 87,7 86,8 86,2 87,4 86,5 86,1 83,3 82,9 82,3 82,0 84,3 83,8 83,9 83,5 86,7 83,1 82,3 81,4 82,2 79,6

Rhodobacter capsulatus 15,7 13,0 11,7 13,2 13,6 95,1 88,7 85,4 85,5 85,6 87,0 85,5 86,2 81,8 81,7 81,6 80,4 82,9 83,3 83,4 82,2 85,0 81,7 80,2 80,4 80,6 78,4

Rhodobacter sphaeroides 13,0 11,6 11,6 13,2 12,9 5,0 89,2 85,8 86,7 87,2 87,7 86,1 86,6 82,6 82,1 81,5 81,1 83,2 83,4 83,1 82,3 84,6 81,4 81,1 81,6 81,4 79,5

Hyphomonas jannaschiana 14,5 13,0 11,5 13,0 13,9 12,3 11,7 87,2 87,4 86,8 87,5 86,5 87,5 83,3 83,7 82,2 81,0 84,3 84,5 84,5 83,1 85,4 82,5 81,3 81,0 81,5 80,5

Erythrobacter longus 15,7 15,5 13,3 14,3 13,4 16,2 15,7 14,1 92,0 91,1 85,3 85,7 86,1 82,3 83,2 80,6 80,7 83,6 83,8 83,2 82,2 84,3 82,2 81,2 81,5 82,6 80,6

Sphingomonas capsulata 16,3 14,8 12,2 13,8 14,6 16,1 14,6 13,9 8,5 91,7 86,1 86,0 86,0 82,2 82,3 79,5 79,7 83,5 83,8 83,6 82,4 84,8 81,3 81,2 80,8 81,4 80,7

Sphingomonas paucimobilis 15,4 15,0 14,1 15,8 15,2 16,0 14,0 14,6 9,4 8,8 86,7 86,8 85,9 82,4 82,1 79,0 79,6 83,3 83,6 83,5 82,6 84,8 81,8 81,2 80,1 81,7 80,7

Azospirillum lipoferum 13,6 12,1 13,2 13,8 13,8 14,3 13,5 13,7 16,4 15,4 14,6 89,7 88,4 82,5 82,0 80,7 81,0 85,1 85,2 84,7 83,8 87,7 83,2 81,2 81,8 81,3 80,3

Magnetospirillum magnetotacticum 14,3 13,6 14,4 14,9 14,8 16,2 15,4 14,9 15,8 15,5 14,5 11,1 88,2 82,6 81,9 80,7 80,1 84,1 83,9 83,7 81,9 85,7 81,5 80,9 80,8 81,4 80,6

Rhodospirillum rubrum 15,1 15,3 14,1 15,1 15,4 15,3 14,8 13,7 15,4 15,6 15,6 12,6 12,8 83,6 83,0 82,1 81,4 83,2 83,3 83,0 81,3 85,3 82,6 82,1 82,1 82,3 81,5

Anaplasma marginale 20,8 20,8 19,9 19,2 18,9 20,8 19,8 18,8 20,1 20,4 20,1 19,9 19,8 18,5 92,4 87,6 85,3 84,7 84,7 84,7 83,0 83,7 82,3 79,6 80,9 81,4 79,8

Cowdria ruminantium 21,6 20,4 20,1 19,4 19,4 20,9 20,4 18,4 19,0 20,2 20,4 20,6 20,7 19,2 8,1 87,6 84,7 84,2 83,9 84,4 80,8 83,1 81,9 79,5 80,4 80,5 77,9

Wolbachia pipientis 21,9 21,8 20,5 20,1 20,2 21,1 21,2 20,4 22,4 23,9 24,6 22,4 22,3 20,5 13,6 13,5 84,1 84,4 84,4 84,4 81,8 82,8 81,2 79,6 80,1 80,8 78,9

Ehrlichia sennetsu 22,7 22,5 21,0 22,0 20,5 22,7 21,7 21,9 22,4 23,6 23,8 22,0 23,2 21,4 16,4 17,1 17,9 82,7 83,1 83,3 80,6 81,2 80,2 78,7 78,8 80,0 77,4

Rickettsia typhi 19,1 18,4 17,6 17,1 17,7 19,5 19,0 17,6 18,5 18,6 18,8 16,6 17,9 19,0 17,1 17,8 17,5 19,7 99,5 98,6 82,9 85,4 83,4 80,9 81,0 82,1 78,0

Rickettsia prowazekii 19,0 18,7 17,7 17,4 18,2 18,8 18,8 17,3 18,2 18,2 18,5 16,5 18,1 18,8 17,1 18,1 17,5 19,2 0,5 98,6 83,5 85,3 83,6 81,3 81,6 82,0 78,6

Rickettsia rickettsii 19,3 18,8 17,7 17,1 18,2 18,8 19,1 17,3 19,0 18,5 18,6 17,1 18,3 19,3 17,1 17,5 17,5 18,9 1,4 1,4 83,4 85,0 83,5 81,3 81,4 82,5 78,3

NHP vi khuẩn 19,4 19,6 19,8 20,1 18,6 20,3 20,1 19,2 20,4 20,1 19,8 18,3 20,7 21,5 19,3 22,2 20,9 22,5 19,4 18,7 18,7 87,4 84,1 79,6 79,1 80,3 77,6

Caedibacter caryophila 16,0 16,3 15,2 15,2 14,6 16,7 17,2 16,2 17,7 16,9 16,9 13,5 15,9 16,3 18,4 19,2 19,5 21,6 16,2 16,4 16,8 13,8 86,4 82,1 80,6 81,3 80,5

Holospora obtusa 18,1 19,3 17,9 19,6 19,1 21,0 21,4 20,0 20,3 21,4 20,9 19,0 21,2 19,8 20,2 20,7 21,6 23,0 18,7 18,5 18,7 17,8 15,0 79,2 78,8 80,7 78,0

Piscirickettsia salmonis 22,0 22,1 20,4 20,3 20,3 22,9 21,8 21,5 21,6 21,6 21,7 21,6 22,0 20,4 23,8 23,9 23,8 25,0 22,1 21,5 21,4 23,8 20,4 24,4 87,2 87,6 85,5

NIX vi khuẩn 22,1 21,9 21,1 19,4 21,3 22,7 21,1 22,0 21,2 22,2 23,1 20,8 22,1 20,4 22,1 22,8 23,1 24,9 21,9 21,1 21,4 24,4 22,5 24,9 14,0 87,0 84,7

Coxiella burnetii 20,5 21,4 21,0 21,0 20,3 22,4 21,4 21,2 19,8 21,3 21,0 21,5 21,4 20,2 21,4 22,6 22,1 23,2 20,4 20,6 19,9 22,9 21,4 22,4 13,6 14,3 84,8

Escherichia coli 23,8 23,9 22,4 23,7 23,9 25,4 23,9 22,6 22,4 22,3 22,3 22,8 22,5 21,2 23,5 26,2 24,8 26,9 26,0 25,2 25,6 26,7 22,6 26,0 16,1 17,2 17,0

một

Số trên đường chéo đại diện cho tỷ lệ tương tự chưa được sửa chữa, và những người bên dưới đường chéo là tỷ lệ phần trăm của sự khác biệt cho nhiều thay đổi cơ sở sửa chữa theo phương pháp của Jukes và Cantor (18).

VOL. 62, 1996 phát sinh học VÀ PHÁT HIỆN chỗ của vi khuẩn NHP 3441joining cây được thực hiện với MEGA chương trình (22), với 500 resamplings

và pairwise loại bỏ dữ liệu không đầy đủ.

rRNA thăm dò thiết kế và tổng hợp. Phân tích sự trợ giúp của máy vi tính của 16S

trình tự rDNA cho thấy ba phân đoạn chuỗi axit nucleic được duy nhất

vi khuẩn NHP (Bảng 2). Các trình tự (prV2, prV6, và prV8) phạm vi

18-22 nucleotide và có nguồn gốc từ vùng biến đổi được công nhận (V2,

, Động cơ V6 và V8, tương ứng) của trình tự 16S rDNA. Một 16S eubacterial phổ quát

thăm dò phục vụ như một điều khiển tích cực (19). Đối với mỗi trình tự, nhân bản đầu dò mà

liên hợp isothiocyanate fluorescein hoặc Rhodamine một huỳnh quang

phái sinh (Texas đỏ; Clonetech) được sản xuất. Oligonucleotide đầu dò

được tổng hợp (ứng dụng mô hình tổng hợp DNA Biosystems 380 B), và

fluorochrome nhãn đã được liên hợp với một mối liên kết phosphate aminoethyl (Ami-

nolink I; Applied Biosystems) kết hợp vào cuối 59 của oligonucleotide.

Thiết bị thăm dò đã được tinh chế bằng Waters sắc ký lỏng với áp suất cao một

sắc ký ban đầu 810 máy trạm.

Mô phần chuẩn bị và điều kiện lai tạo thăm dò. Bị nhiễm P.

tôm thẻ chân trắng tôm đã được thu được trong một ổ dịch tự nhiên của NHP ở Texas.Các

hepatopancreata mẫu vật sống đã được tiêm thuốc định hình Davidson

(16), tôm đã được mổ xẻ, và cơ quan đã được gỡ bỏ từ tôm mỗi.

Gan tụy được đắm mình trong định hình Davidson trong 24 h, chuyển giao cho

70% ethanol, và xử lý để kiểm tra mô học thường xuyên. Paraffin-nhúng-

mẫu vật ded được sectioned 3 đến 4 mm và được gắn trên tích điện dương

slide (Fisher Scientific, Pittsburgh, bang Pennsylvania). Các phần đã deparaffinized bằng

được gia nhiệt ở 658C trong 20 phút và sau đó được đắm mình trong Xylen trong 2 phút,

với ba thay đổi của xylene. Các slide được hydrat bằng cách ngâm trong 1 phút

trong mỗi trong những giải pháp ethanol phân loại sau đây: tuyệt đối, 95%, 75%, 50%, và

cuối cùng cất nước. Các slide sau đó đã được đắm mình trong 15 phút-phosphate

đệm dung dịch muối (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4.3 mM NaH2PO4 z 7H2O,

1,4 mM KH2PO4 pH 7,3) tại 458C và ủ trong một giải pháp proteinase K (100.

mg / ml PBS) trong 15 phút ở 378C. Các slide được equilibrated với 1,6 mM

dithiothreitol (Boehringer Mannheim) PBS trong 10 phút ở 458C và bị chặn

với 1,6 mM dithiothreitol-1.6 mM iodoacetemide (Aldrich Chemical, Milwau

kee, Wisconsin) -1,59 mM N-ethylmaleimide (Sigma, St Louis, Missouri) PBS trong 30 phút

ở 458C. Các slide được rửa hai lần cho 5 phút trong PBS ở nhiệt độ phòng (RT;

258C) và equilibrated Triethanolamine 1,75% (TEA; Sigma) (pH 8,0) tại RT.

Các trang trình bày đã được chuyển giao cho anhydride acetic tươi TEA-0,25% (Sigma) cho 5

phút ở RT và sau đó chuyển giao cho anhydride acetic TEA 0,5% trong 5 phút ở RT.

Các trang trình bày đã bị chặn trong 23 Ủy ban Chứng khoán Nhà nước (13 Ủy ban Chứng khoán Nhà nước là 0.15MNaCl cộng 0.015Msodium

citrate) cho 5 phút ở RT và sau đó được đắm mình trong H2O cất 5 phút ở RT. Các

đầu dò được pha loãng trong cocktail lai (Aprogenex Inc, Houston, Texas),

và 30 đến 50 ml của giải pháp này được áp dụng cho slide. Một sự tập trung của 0,04

mg / ml đã được sử dụng cho các đầu dò được dán nhãn với fluorescein isothiocyanate, và một con

centration 0,02 mg / ml đã được sử dụng cho các đầu dò gắn nhãn với Texas đỏ.Coverslips

được đặt trên các trang trình bày, và các trang trình bày đã được ủ trong một căn phòng ẩm ướt

ở 428C trong 10 phút và sau đó được chuyển cho 45 s một cái vi để nướng prewarmed đặt ở

928C. Các trang trình bày đã được trả lại cho căn phòng ẩm ướt và ủ 5-16

giờ ở 428C trong bóng tối. Sau khi lai tạo, các trang trình bày đã được rửa sạch trong

Aprogenex Rửa tại 428C trong 15 phút và chuyển Aprogenex Rửa B

RT cho 10 phút với hai thay đổi. Các slide được gắn trong hoặc propidium

iodide / Antifade (Oncor) hoặc Vectashield (Vector phòng thí nghiệm, Inc, Burlingame,

California) và xem trên kính hiển vi BH10 Olympus trang bị với huỳnh quang

khả năng. Photomicrographs được chụp với Kodak Ektachrome site kia-135

(PS 1600) bộ phim và đẩy mạnh chế biến tại 1.600 ASA.

Số nhập chuỗi nucleotide. Các trình tự của vi khuẩn

chủng được duy trì trong EMBL, GenBank và cơ sở dữ liệu dự án ribosome

cơ sở dữ liệu trình tự nucleotide và có sẵn bằng cách thu hồi điện tử. Các

số gia nhập các chuỗi vi khuẩn trong cơ sở dữ liệu GenBank như

sau: Afipia felis, M65248 Agrobacterium tumefaciens, M11223; Anaplasma

marginale, M60313, Azospirillum lipoferum, Z29619; Beijerinckia indica M59060;

Brucella abortus, X13695; Caedibacter caryophila, X71837, Cowdria ruminantium

X61659; Coxiella burnetii, M21291; Ehrlichia sennetsu, M73225; Erythrobacter

longus, M59062, Escherichia coli, J01695; Hyphomonas jannaschiana, M83806;

Magnetotacticum Magnetospirillum, M58171, NIX vi khuẩn, M94381; Piscirick

ettsia salmonis, X60783; Rhodobacter capsulatus, D16428, Rhodobacter sphae

roides, D16425; Rhodospirillum rubrum, D30778; Rickettsia prowazekii, M21789;

Rickettsii Rickettsia, M21293, Rickettsia typhi, M20499, Sphingomonas capsulata

D16147; Sphingomonas paucimobilis, D13725, vi khuẩn Wolbachia pipientis, X61768.Các

trình tự cho Holospora obtusa là duy trì trong các dữ liệu trình tự nucleotide

cơ sở của dự án ribosome cơ sở dữ liệu theo Hol.obtusa số lượng nhập.

16S rDNA trình tự của các vi khuẩn NHP đã được trình lên

EMBL và cơ sở dữ liệu GenBank. Việc gia nhập GenBank số cho NHP

là vi khuẩn U65509.

Hình 1. Phát sinh loài cây so sánh các loại vi khuẩn NHP với các thành viên khác nhau của một-và g Proteobacteria. Số lượng tại các điểm chi nhánh mô tả%

xuất hiện của một chi nhánh trong thời gian 500 resamplings của phân tích bootstrap.

3442 Loy ET AL. APPL.ENVIRON.MICROBIOL.RESULTS VÀ THẢO LUẬN

Gần như toàn bộ các 16S rDNA (1.416 cơ sở) của NHP bac

terium được khuếch đại, nhân bản, và giải trình tự cho phát sinh loài

vị trí của sinh vật. Trình tự 16S rDNA của

Vi khuẩn NHP được so sánh 23 với những thành viên của

một lớp con của lớp Proteobacteria Proteobacteria (a) và

4 thành viên của g-Proteobacteria, và ma trận tương tự như cho

so sánh này được thể hiện trong Bảng 3. Một cây phát sinh loài con

structed từ các dữ liệu giống nhau bằng cách sử dụng hàng xóm-tham gia

phương pháp rõ ràng cho thấy rằng vi khuẩn NHP là một

thành viên của một Proteobacteria (Hình 1). Hiệp hội của

NHP vi khuẩn với một Proteobacteria được hỗ trợ bởi

thực tế là phân khu này bao gồm rất nhiều vi khuẩn đã hình thành

thân mật và thường trong tế bào liên kết với sinh vật nhân chuẩn

(34, 43, 44). Trong một loại vi khuẩn-Proteobacteria, NHP

hình thành một cụm monophylotetic với các vi khuẩn có

được bao gồm trong bốn phân nhóm được công nhận (a-1, a-2, một-3,

và một-4) (a-Proteobacteria 36). Các vi khuẩn này

cụm bao gồm thành viên của gia đình Rickettsiaceae (A. mar

ginale, C. ruminatum, W. pipientis, E. sennetsu, R. typhi, R.

prowazekii, và R. rickettsii), cũng như protozoal endosym

bionts caryophila C. và H. obtusa. Vi khuẩn NHP

tương tự như C. caryophila (87,4%) và H. obtusa (84,1%)

và thấp hơn một chút tương tự như ba loài Rickettsia, R.

prowazekii, R. typhi, và R. rickettsii (khoảng 83,5%).

Trong nghiên cứu này, các vi khuẩn NHP được thể hiện được hầu hết

chặt chẽ liên quan đến C. caryophila, một vi khuẩn cộng sinh protozoal

macronucleus Paramecium caudatum. Sự kết hợp của

vi khuẩn NHP với C. caryophila là hấp dẫn, bởi vì

một số tính năng quan trọng là phổ biến cho cả sinh vật. Như

thấy trong vi khuẩn NHP, C. caryophila và tương đối chặt chẽ

Holospora obtusa triển lãm nhiều hình thức khác biệt hình thái

(29). C. caryophila, những hình thức bao gồm một nonbright (như

xác định bằng kính hiển vi tương phản pha) hình thức sinh sản

và lớn hơn refractile, sáng hình thức (32). H. obtusa được biết đến

có một hình thức truyền nhiễm, tạo thành một replicative, và một trung gian

ăn hình thức (gọi là hình thức kích hoạt truyền nhiễm) (15). Tuy nhiên,

C. caryophila được phân biệt từ các loại vi khuẩn NHP và

endosymbionts kẻ giết người khác bởi vì nó sản xuất refractile

clusions bao gồm các chặt chẽ cuộn băng proteinaceous (33).

Những cơ quan được gọi là R đã không được quan sát thấy trong NHP

vi khuẩn.

Một sự biện hộ chính để theo đuổi phát sinh loài classifica

tion của vi khuẩn NHP là để đạt được cái nhìn sâu sắc vào hệ sinh thái của nó

và trong các yêu cầu văn hóa tinh trong ống nghiệm. Khi phát sinh loài loại

là tiên đoán, những thông tin mà được biết đến một cơ quan

ism nói chung có thể được áp dụng cho người thân của mình (26, 39). C.

caryophila được mô tả như là vi khuẩn cộng sinh của vi khuẩn bắt buộc,

và không có gì là nổi tiếng về sự bền bỉ của nó bên ngoài máy chủ

Paramecia (33). Như chúng ta đã chứng minh cho NHP

vi khuẩn (13), C. caryophila có thể được lọc bằng cách ly tâm

nhưng đã không được canh tác trên làm phong phú phương tiện truyền thông, và không phải là C.

caryophila cũng không obtusa H. đã được trồng bên ngoài chủ của nó

paramecium (32, 33). Mặc dù sự kết hợp của các NHP

vi khuẩn với C. caryophila và H. obtusa không phải là thông tin

đối với yêu cầu văn hóa in vitro của NHP bac

terium, nó có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc vào hệ sinh thái của sinh vật

trong môi trường ao nuôi. Protozoans Epicommensal com-

đại lý ô nhiễm mon sống trên các bề mặt cuticular, mang, và

phụ của P. tôm thẻ chân trắng (11). Nhiễm ánh sáng với những

sinh vật không liên quan với bệnh tật, và sự hiện diện của họ

được coi là ngẫu nhiên (23). Tuy nhiên, theo quan điểm của các phylo

Hình 2. Gan tụy của tôm trắng Thái Bình Dương bị nhiễm vi khuẩn NHP. Con số này thể hiện một tín hiệu tích cực huỳnh quang trong nhiều nhiễm

biểu mô tế bào. Probe prV8 dán nhãn với fluorescein isothiocyanate đã được sử dụng.

VOL. 62, 1996 phát sinh học VÀ PHÁT HIỆN chỗ NHP vi khuẩn 3443genetic kết hợp của vi khuẩn NHP với một nội bào

vi khuẩn cộng sinh của động vật nguyên sinh, khả năng rằng epicommen-

sal sinh vật đơn bào nuôi dưỡng vi khuẩn NHP nên investi

gated.

Các phân tích trình tự cũng đã chứng minh rằng các bac-NHP

terium là khác biệt từ nhưng liên quan đến Rickettsia spp. và họ

người thân. Hiệp hội này hấp dẫn là được hỗ trợ bởi các sự kiện

rằng vi khuẩn NHP là một tác nhân gây bệnh nội bào của một ma-

rine không xương sống và nhiều của các rickettsias lây nhiễm các midgut

epithelia của vector động vật không xương sống của họ. Tuy nhiên, độc đáo

các tính năng hình thái của vi khuẩn NHP, không đầy đủ

kiến thức về chu kỳ sống của sinh vật, và xa

sự khác nhau của vi khuẩn NHP từ phylogenetically clas-

sinh vật sified trong một-Proteobacteria loại trừ vị trí của

vi khuẩn NHP trong một chi được xác định (9).

Sự vắng mặt của các dòng tế bào tôm và kiến ​​thức không đầy đủ

về các yêu cầu phát triển phức tạp của vi khuẩn NHP

đã ngăn chặn trong ống nghiệm canh tác của nền văn hóa tiêu chuẩn meth

ods. Trong sự vắng mặt của một nền văn hóa thuần khiết của vi khuẩn NHP, một

sucrose mật độ gradient giàu cô lập phục vụ như là tem

tấm DNA để khuếch đại PCR của 16S rDNA. Tổng

mồi PCR prokaryote có khuếch đại 16S rDNA từ một

phạm vi rộng của vi khuẩn đã được sử dụng để khuếch đại các 16S rDNA của

vi khuẩn NHP (38). Mặc dù các vi khuẩn làm giàu iso-

cuối đã được chứng minh để tái sản xuất NHP trong một nghiên cứu trước

(13), mồi không đặc hiệu có thể khuếch đại 16S

rDNA của chất gây ô nhiễm vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, nguồn gốc của

nhân bản 16S rDNA được xác nhận là NHP bac-

terium bởi huỳnh quang lai tại chỗ. Trong lai tại chổ

là cách trực tiếp nhất để liên kết một trình tự 16S rRNA để một

xác định vi khuẩn morphotype (3, 6, 40). Chuỗi dữ liệu

tạo ra từ nghiên cứu này được phân tích, và oligonucleotide

đầu dò rằng lai giống ba khu vực khác nhau biến (V2,

V6 và V8) của vi khuẩn NHP 16S rRNA đã được thiết kế

và thử nghiệm bởi trong lai tại chổ. Các đầu dò được so sánh

với các dữ liệu trình tự trong cơ sở dữ liệu ribosome và phát hiện không có

trận đấu với ít hơn ba cặp cơ sở không phù hợp (25). Fur-

thermore, cả ba thiết bị thăm dò sản xuất oligonucleotide dem

onstrated cụ thể trong tín hiệu lai tại chổ từ tôm

hepatopancreata đã bị nhiễm vi khuẩn NHP,

do đó chứng thực nguồn gốc của các nhân bản và trình tự

16S rDNA vi khuẩn NHP (Hình 2). Hy-tích cực

bridization tín hiệu địa hoá đến các tế bào chất của hepatopancre

ATIC biểu mô tế bào đã được chứng minh là bị nhiễm

NHP vi khuẩn bằng cách sử dụng tương đồng phần màu

phương pháp Steiner và Steiner (Hình 3) (14). Không lai

tín hiệu đã được thu được khi các đầu dò NHP-cụ thể là hy-

bridized để mô tôm không bị nhiễm bệnh, tôm sú mô trong

fected với một loại vi khuẩn khác nhau như rickettsia, và tôm

mô bị nhiễm với vi khuẩn Vibrio spp. Tôm bị nhiễm trong nội bộ

tế bào vi khuẩn (vi khuẩn NHP hoặc P. monodon rickettsia-

sinh vật), và các mô bị nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. chứng minh

lai một tín hiệu tích cực khi ủ với một eubacte

Rial 16S thăm dò (19).

Mặc dù các đầu dò axit nucleic cho thấy hứa hẹn trong chẩn tôm

nostic bệnh lý kiểm tra (5), sử dụng rộng rãi huỳnh quang trong

lai tạo tại chỗ trong chẩn đoán tôm là không vì

autofluorescence của các cấu trúc kitin nhiều cuticular

tôm. Autofluorescence nền này đã được tránh trong

nghiên cứu này thông qua việc sử dụng các prosected hepatopancre

ata. Autofluorescence ít hoặc không được quan sát thấy trong gan

tuyến tụy, và các tín hiệu mạnh mẽ huỳnh quang dễ dàng kỳ thị

NAT bị nhiễm bệnh từ các tế bào biểu mô không bị nhiễm bệnh. Phát hiện

các vi khuẩn NHP với 16S rRNA đầu dò huỳnh quang

Tuy nhiên, có thể, cung cấp một phương tiện xác định chu kỳ sống của

vi khuẩn NHP bên ngoài biểu mô tế bào chủ. Như vậy

Hình 3. Gan tụy của tôm trắng Thái Bình Dương bị nhiễm vi khuẩn NHP. Mẫu vật là tương tự như mô tả trong hình. 2. Trong tế bào vi khuẩn

(Mũi tên) là hiển nhiên. Các phương pháp Steiner và Steiner đã được sử dụng. Quây bar, 10 mm.

3444 Loy ET AL. APPL.ENVIRON.MICROBIOL.knowledge có thể quan trọng trong việc thiết lập tránh Mecha

nisms và do đó ngăn ngừa tỉ lệ chết phổ biến hiện nay

kết hợp với NHP trong các quần thể nuôi của P. tôm thẻ chân trắng.

NHAÄN

Nghiên cứu này được tài trợ, một phần, theo cấp H-8158 từ

Thử nghiệm Nông nghiệp Texas Station, Texas A & hệ thống MUniversity.

Tài liệu tham khảo

1. Altschul, SF, W. Gish, W. Miller, EW Myers, và DJ Lipman. Năm 1990.

Công cụ tìm kiếm sự liên kết cơ bản địa phương. J. Mol. Biol. 215:403-410.

2. Amann, R. I., L. Krumholtz, và D. A. Stahl. Năm 1990. Ánh đèn huỳnh quang-oligonucle-

otide thăm dò của các tế bào toàn cho quyết tâm, phát sinh loài, và môi trường

tinh thần nghiên cứu vi sinh. J. Bacteriol. 172:762-770.

3. Amann, RI, N. Springer, W. Ludwig, và KH Schleifer. Năm 1991. Identifi-

cation tại chỗ và phát sinh học endosymbionts vô văn vi khuẩn. Thiên nhiên

(London) 351:161-164.

4. Braun-Howland, EB, SA Danielsen, và SA Nierzwicki-Bauer. Năm 1991.

Phát triển một phương pháp nhanh chóng để phát hiện các tế bào vi khuẩn trong 16S tại chỗ bằng cách sử dụng

mục tiêu đầu dò rRNA-. BioTechniques 13:928-933.

5. Bruce, LD, RM Redman, DV Lightner, và JR Bonami. Năm 1993.

Áp dụng các đầu dò gen để phát hiện baculovirus tôm penaeid trong cố định

mô sử dụng trong lai tại chổ. Dis. Aquat. Org. 17:215-221.

6. Delong, E. F. G. S. Wickham, và N. R. Pace. Năm 1989. Phát sinh loài vết bẩn:

ribosome RNA thăm dò dựa trên việc xác định các tế bào duy nhất. Khoa học

243:1360-1362.

7. Dewhirst, E. F., B. J. Paster, và P. L. Bright. Năm 1989. Chromobacterium,

Eikenella, Kingella, Neisseria, Simonsiella, và Vitreoscilla loài bao gồm một

chính chi nhánh của nhóm beta Proteobacteria bởi 16S ribonucleic acid se-

quence so sánh: chuyển giao Eikenella, và Simonsiella, gia đình

Neisseriacae (emend.). Int. J. Syst. Bacteriol. 40:426-433.

8. Dewhirst, FE, C. Seymour, BJ Fraser, và JG Fox. Năm 1994. Phát sinh học của

Helicobacter phân lập từ gia cầm và phân lợn và mô tả của Helico

bacter pametensis sp. Tháng mười một Int. J. Syst. Bacteriol. 44:553-560.

9. Drancourt, M. và D. Raoult. Năm 1994. Vị trí phân loại của Rickettsiae:

hiện kiến ​​thức. FEMS Microbiol. Rev 13:13-24.

10. Edman, JC, JA Kovaks, H. Masur, DV Santi, HJ Elwood, ML

Sogin. Năm 1988. Chuỗi RNA ribosome cho thấy Pneumocystis Carini là một

thành viên của các loại nấm. Thiên nhiên (London) 334:519-522.

11. Foster, C. A., T. J. Sarphie, và W. E. Hawkins. Năm 1978. Mỹ cấu trúc của

peritrichous ectocommensal Zoothamnium sp. với sự nhấn mạnh vào chế độ

kèm theo tôm penaeid. J. Cá Dis. 1:321-335.

12. Fox, GE, E. Stackebrandt, RB Hespel, J. Gibson, JJ Maniloff, TA

Dyer, RS Wolfe, CHÚNG TÔI Balch, RS Tanner, LJ Magrum, LB Zablem,

R. Blackmore, R. Gupta, L. Bonen, BJ Lewis, DA Stahl, KR Luen

hersen, K. N. Chen, và C. R. Woese. Năm 1980. Phát sinh học prokaryotes.

Khoa học 209:457-463.

13. Frelier, P. F., J. K. Loy, và B. Kruppenbauch. Năm 1992. Lây truyền

hoại tử hepatopancreatitis Penaeus vannamei. J. Invertebr. Pathol.

61:44-48.

14. Frelier, P. F., R. F. Sis, T. A. Bell, và Lewis. Năm 1992. Kính hiển vi và

nghiên cứu siêu hepatopancreatitis hoại tử ở Thái Bình Dương trắng

tôm (Penaeus vannamei) nuôi ở Texas. Vet. Pathol. 29:269-277.

15. Gortz, H.-D., S. Lellig, O. Miosga, và M. Wiemann. Năm 1990. Thay đổi tiền phạt

cấu trúc và mô hình polypeptide trong quá trình phát triển của Holospora obtusa,

một loại vi khuẩn lây nhiễm vào macronucleus Paramecium caudatum. J. Bacte -

riol. 172:5664-5669.

16. Humason, G. L. 1979. Thủ tục đặc biệt I, p. 463. D. L. Humason (ed.),

Các kỹ thuật mô động vật. W. H. Freeman & Co, San Francisco.

17. Johnson, S. K. năm 1989. Biểu hiện tuyến tiêu hóa, p. 16. Trong S. K. Johnson

(Ed.), Sổ tay của bệnh tôm, Sea Grant College Chương trình Texas

A & M University, Galveston, bang Texas

18. Jukes, T. H., C. R. Cantor. Năm 1969. Sự tiến hóa của các phân tử protein, tr.

21-132. HN Munro (ed.), protein động vật có vú trao đổi chất, vol. 3.

Academic Press, Inc, New York.

19. Jurtshuk, RE, M. Blick, J. Bresser, GE Fox, và P. Jurtshuk. Năm 1992.

Nhanh chóng trong kỹ thuật lai tại chỗ bằng cách sử dụng 16S rRNA phân đoạn cho detec

tion và sự khác biệt gram dương tính liên quan chặt chẽ sinh vật Bacillus

polymyxa và macerans Bacillus. Appl. Môi trường. Microbiol. 58:2571-2578.

20. Kerk, D., A. Gee, FE Dewhirst, AS Drum, và RA Elston. Năm 1992.

Vị trí phát sinh loài của X bao gồm hạt nhân (NIX) vào gamma phụ

phân chia Proteobacteria trên cơ sở của 16S chuỗi RNA ribrosomal

so sánh. Syst. Appl. Microbiol. 42:439-445.

21. Krol, R. M., W. E. Hawkins, và R. M. Overstreet. Năm 1992. Rickettsial và

mollicute nhiễm trùng trong các tế bào hepatopancreatic của văn hóa Thái Bình Dương trắng

tôm (Penaeus vannamei). J. Invertebr. Pathol. 57:362-370.

22. Kumar, S., K. Tamura, andM. Nei.MEGA: phân tử tiến hóa di truyền học

phân tích, phiên bản 1.0. Đại học bang Pennsylvania, Đại học Park, Pa.

23. Lightner, D. V. 1988. Protozoal ô nhiễm bệnh của tôm penaeid, p. 76-79.

Trong CJ Sindermann và DV Lightner (ed.) chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh

ở Bắc Mỹ biển nuôi trồng thuỷ sản. Elsevier xuất bản Khoa học, Inc,

New York.

24. Lightner, D. V., R. M. Redman, và J. R. Bonami. Năm 1992. Hình thái

bằng chứng về nguyên nhân vi khuẩn duy nhất ở Texas hoại tử hepatopancre

atitis trong Penaeus tôm thẻ chân trắng (giáp xác: Decapoda). Dis. Aquat. Org. 13:235 -

239.

25. Maidak, BL, N. Larsen, MJ McCaughey, R. Overbeek, GJ Olsen, K.

Fogel, J. Blandy, và C. R. Woese. Năm 1994. Dự án Cơ sở dữ liệu ribosome.

Axit nucleic Res. 22:3485-3489.

26. Olsen, GJ, DJ Lane, SJ Giovannoni, NR Pace, và DA Stahl. Năm 1986.

Vi sinh vật sinh thái và tiến hóa: một cách tiếp cận RNA ribosome. Annu. Rev.

Microbiol. 40:337-365.

27. Olsen, G. J., và C. R. Woese. Năm 1993. RNA ribosome: một chìa khóa để phát sinh học.

FASEB J. 7:113-123.

28. Paster, B. J., và F. E. Dewhirst. Năm 1988. Phát sinh học của campylobacters, woliel-

las, Bacteroides gracilis, và Bacteroides ureolyticus bởi 16S ribosome ribonu

cleic axit trình tự. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:56-62.

29. Preer, J. R., và L. B. Preer. Năm 1982. Sự hồi sinh của tên protozoal endosym

bionts và đề nghị của Holospora caryophila nom. Tháng mười một Int. J. Syst. Bacteriol.

32:140-141.

30. Relman, DA, JS Loutit, TM Schmidt, S. Falkow, và LS Tompkins.

Năm 1990. Các đại lý của bacillary angiomatosis. Một cách tiếp cận để xác định

tác nhân gây bệnh vô văn. N. Engl. J. Med. 323:1573-1580.

31. Saitou, N., và Nei M.. Năm 1987. Người hàng xóm tham gia phương pháp: một phương pháp mới

để xây dựng lại cây phát sinh loài. Mol. Biol. Evol. 4:404-425.

32. Schmidt, H. J., H.-D. Gortz, và R. L. Quackenbush. Năm 1987. Caedibacter

caryophila sp. Tháng Mười Một, một vật cộng sinh giết người, sinh sống macronucleus của. Para-

mecium caudatum. Int. J. Syst. Bacteriol. 37:459-462.

33. Springer, N., W. Ludwig, R. Amann, HJ Schmidt, H.-D. Gortz, và K.-H.

Schleifer. Năm 1993. Sự xuất hiện của phân mảnh 16S rRNA trong một vi khuẩn bắt buộc

vi khuẩn cộng sinh của Paramecium caudatum. Proc. Natl. Acad. Khoa học viễn tưởng.Hoa Kỳ 90:

9892-9895.

34. Stackebrandt, E., RGE Murray, và HG Truper. Năm 1988. Proteobacteria

classis Tháng Mười Một, một tên cho các đơn vị phân loại phát sinh loài bao gồm màu tím ".

vi khuẩn và thân nhân của họ "Int. J. Syst. Bacteriol. 38:321-325.

35. Stahl, D. A., và R. Amann. Năm 1991. Phát triển và ứng dụng của nucleic

đầu dò axit, p. 205-248. E. Stackebrandt và M. Goodfellow (ed.), Nu-

cleic axit kỹ thuật trong hệ thống học vi khuẩn. John Wiley & Sons, Inc, New

York.

36. Takeuchi, M., H. Sawada, H. Oyaizu, và A. Yokota. Năm 1994. Phát sinh loài

bằng chứng cho Sphingomonas và Rhizomonas là thành viên nonphotosynthetic

của lớp con alpha-4 của các Proteobacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 44:308 -

314.

37. Tamura, A., U. Urakami, và T. Tsuruhara. Năm 1982. Thanh lọc của Rickettsia

tsutsugamushi bởi Percoll ly tâm Gradient mật độ. Microbiol. Immu-

Thư không phản đối. 26:321-328.

38. Weisburg, WG, SM kho, DA Pelletier, và ngõ DJ. Năm 1991. 16S

ribosome DNA khuếch đại cho nghiên cứu phát sinh loài. J. Bacteriol. 173:697 -

703.

39. Weisburg, W. G., T. P. Hatch, và C. R. Woese. Năm 1986. Eubacterial nguồn gốc của

chlamydiae. J. Bacteriol. 167:570-574.

40. Wetmer, J. G. 1991. DNA đầu dò: ứng dụng các nguyên tắc của nucleic

axit lai. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259.

41. Wilson, KH, R. Blitchington, R. Frothingham, và JAP Wilson. Năm 1991.

Phát sinh học của vi khuẩn liên quan đến bệnh Whipple's. Lancet 338:474 -

475.

42. Wilson, KH, RH Blitchington và RG Greene. Năm 1990. Khuếch đại

16S DNA ribosome vi khuẩn với phản ứng chuỗi polymerase. J. Clin. Mi-

crobiol. 28:1942-1946.

43. Woese, C. R. 1987. Vi khuẩn tiến hóa. Microbiol. Rev. 51:221-227.

44. Woese, CR, E. Stackebrandt, WG Weisberg, BJ Paster, MT Madigan,

VJ Fowler, CM Hahn, P. Blantz, R. Gupta, KH Nealson, và GE Fox.

Năm 1984. Phát sinh học vi khuẩn màu tím: phân khu alpha. Syst. Appl.

Microbiol. 5:315-326.

VOL. 62, 1996 phát sinh học VÀ PHÁT HIỆN chỗ NHP vi khuẩn 3445