Phối tử-sắc ký trao đổi

Trong bài viết này, chúng tôi sẽ thảo luận về phối tử-sắc ký trao đổi: một

kỹ thuật mà bây giờ thường được sử dụng cho việc tách các loại đường và

quang đồng phân.

Chúng tôi đầu tiên sẽ xem xét cơ chế tách. Các chất (các phân tử

hoặc các ion) có tài sản của chấp nhận, tặng điện tử. Đối với

Ví dụ, các ion kim loại có đặc tính của các điện tử chấp nhận và được

được gọi là "nhận electron." Nếu một chất tặng điện tử (một

"Nhà tài trợ điện tử") tồn tại gần một ion kim loại, phức tạp được tạo ra bởi

phối hợp trái phiếu từ chuyển nhượng điện tử giữa hai. Như vậy

các nhà tài trợ điện tử được gọi là "phối tử" Một ví dụ về hiện tượng này.

là các ion kim loại nhất trong khu phức hợp giải pháp dưới dạng dung dịch nước (thủy sản

phức hợp) của các phân tử nước phối hợp. Khi phối tử khác cùng tồn tại

trong một dung dịch nước của các ion kim loại, các phối tử cạnh tranh với các

các phân tử nước và cố gắng để hình thành các phức với các ion kim loại. Điều này

phản ứng được thể hiện qua sự biểu hiện dưới đây:

M (H2O) n + L, / (H2O) n - mL + mH2O

Trong đó, M là một ion kim loại với n số phối hợp và L là một

phối tử với số lượng phối hợp. Phản ứng này trao đổi được biết đến

như là một phối tử trao đổi "phản ứng trao đổi phối tử." sắc ký sử dụng

phản ứng này để các thành phần riêng biệt bằng cách sử dụng lực lượng liên kết khác nhau để

các ion kim loại của mỗi thành phần (phối tử) (có nghĩa là, sự khác biệt trong sự ổn định

) phức tạp trong một cột với các ion kim loại bất động.

Các ion kim loại di động được bởi trái phiếu hoặc trái phiếu ion phối hợp

một loại nhựa với các nhóm chức năng nhúng, chẳng hạn như các nhóm sulfone,

nhóm carboxyl, hoặc các nhóm amin. Trong một số trường hợp thích hợp phối tử

được nhúng vào nhựa. Dung môi có chứa một phù hợp cạnh tranh

phối tử được sử dụng như giai đoạn điện thoại di động. Rửa giải của các thành phần mục tiêu

bằng cách điều chỉnh nồng độ của phối tử cạnh tranh và kiểm soát

pH.

Sự ổn định của phức tạp phụ thuộc vào sự phối hợp, Độ kiềm

số, và steric yếu tố của phối tử. Trong một phối tử polydentate,

kích thước và số lượng các vòng chelate cũng có ảnh hưởng. Sự ổn định của

phức tạp cũng liên quan đến đường kính và phụ trách các ion kim loại.

Ví dụ, một cột đóng gói wi thứ gel polystyrene sunfonat hóa

wi thứ immobi l ized Ca2 +

hoặc PB2 +

ion được sử dụng cho l igand trao đổi

sắc ký của monosacarit. Nước được sử dụng như điện thoại di động

giai đoạn. Các phân tử nước cung cấp các phối tử cạnh tranh. Hình 1 cho thấy

rửa giải vị trí của mỗi monosaccharide thu được bởi Ca và Pb

phối tử-sắc ký trao đổi. Nó cho thấy rằng lưu giữ của một số

các thành phần khác.

Khu phức hợp các loại đường và các ion kim loại được hình thành bởi trái phiếu phối hợp

giữa các ion kim loại và hai nhóm hydroxyl ngoại quan.

carbon liền kề đường. Một phức tạp hình thành khi hai hydroxyl

nhóm thông qua một lu mờ hoặc dáng vụng về, tuy nhiên, không phức tạp

kết quả nếu họ thông qua cấu chống. Do đó, sự ổn định

của khu phức hợp kim loại với mỗi monosaccharide được xác định bởi

dễ dàng thông qua các conformations. Đường rượu chẳng hạn như mannitol

hoặc sorbitol được giữ lại mạnh mẽ, khi họ sẵn sàng chấp nhận một mong muốn

cấu do các nhóm hydroxyl liên quan đến việc hình thành

khu phức hợp. Các giá conformations cyclohexitol vòng hình thành

hoặc pyranose bị hạn chế, như vậy mà khu phức hợp hình thành dễ dàng với

hơn so với rượu đường. Tuy nhiên, sự ổn định của các đường

tăng lên khi ba nhóm hydroxyl có một hình thức của aq-aq-aq.

Trong sắc ký trao đổi phối tử, cấu tạo của một chất

cũng góp phần vào sự tách biệt của nó, như mô tả ở trên. Trong một số trường hợp,

sắc ký trao đổi phối tử cho phép phân tích các thành phần

rằng không thể tách rời trong một chế độ bình thường. Đương nhiên, mục tiêu

các thành phần phải có năng lực phối hợp. Để áp dụng loại hình này

sắc ký, sự phối hợp của các thành phần phải được xem xét

để thiết kế một giai đoạn thích hợp rắn và giai đoạn di động.

Giới thiệu

HPLC

Shimadzu

LC Thế giới Phát hành đặc biệt Talk Volume1

C190-E0932

1. Đảo ngược pha sắc ký 4

2. Đảo ngược pha sắc ký Ion cặp 5

3. Derivatization trong HPLC 6

4. Đảo ngược pha sắc ký và sắc ký Tương tác kỵ nước 7

5. Silica Gel Dựa Đóng gói 8

6. Absorptiometric Phát hiện 9

7. Mối quan hệ sắc ký 10

8. Bình thường giai đoạn sắc ký 11

9. Sắc ký trao đổi phối tử-12

10. Giải thích GLP / GMP ngữ: RSD (C.V.) 13

11. Giải thích GLP / GMP ngữ: Tailing tố, Nghị quyết 14

12. Giới hạn phát hiện 16

13. Thảo luận LC-MS (phần 1) 18

14. Thảo luận LC-MS (phần 2) 19

15. Thảo luận LC-MS (phần 3) 20

16. Tách Đường 21

17. Phát hiện của Đường 22

18. Phát hiện Đường - Tiếp tục 23

19. Detector tán xạ ánh sáng bay hơi 24

20. Phương pháp phân tích Amino Acid 25

21. Phân tích của axit hữu cơ 26

22. Loại trừ sắc ký Kích thước 27

Đây là một trình biên dịch của phần giới thiệu về các vấn đề trong quá khứ của "LCtalk",

Shimadzu của bản tin cho người sử dụng HPLC, phiên bản Nhật Bản. 4

Đảo ngược pha sắc ký HPLC được sử dụng phổ biến nhất

tách chế độ. Nó cao hơn nhiều so với các phương thức khác trong sự đa dạng của

các hợp chất mục tiêu, nó có thể xử lý. Các hiện tượng giữ lại chiếm ưu thế

mẫu trong cột sắc ký pha đảo ngược là

tương tác kỵ nước giữa các pha rắn và mẫu. Hai

loại đóng gói đảo ngược pha sắc ký cột được sử dụng:

loại là một silica gel ma trận với chuỗi alkyl hóa học ngoại quan và các

khác là dựa trên bao bì nhựa. Ngoại trừ trường hợp đặc biệt, silica

gel loại ma trận được sử dụng do số lượng cao của các đĩa lý thuyết. Một

-dựa trên bao bì nhựa phải được sử dụng nếu độ pH của giai đoạn di động được sử dụng

tách được thiết lập bên ngoài phạm vi đó có thể được sử dụng với silica gel

hoặc nếu các nhóm unreacted silanol còn lại trên bề mặt silica gel có

một ảnh hưởng bất lợi về ly thân và vấn đề này không thể được giải quyết

bằng cách thay đổi các thành phần của giai đoạn di động. Tuy nhiên, đây là những

tương đối hiếm trường hợp. Nhóm alkyl điển hình là hóa học

ngoại quan đến silica gel bao gồm các nhóm octadecyl, nhóm octyl, và

nhóm trimethyl (xem hình 1). Còn chuỗi alkyl,

lực lượng duy trì. Cột được lựa chọn theo các kỵ nước

duy trì lực lượng trên các hợp chất mục tiêu. Sử dụng một cột với các yếu

duy trì lực lượng nếu các hợp chất mục tiêu không elute trong một thích hợp

thời gian trong điều kiện giai đoạn di động

cung cấp lực lượng rửa giải mạnh nhất

(100% dung môi hữu cơ). Ngược lại,

sử dụng một cột mạnh mẽ hơn giữ lại

vũ lực nếu các hợp chất mục tiêu không

giữ lại cho thích hợp t ime

theo giai đoạn mobi le Condi t ion

cung cấp lực lượng rửa giải yếu nhất

(100% bộ đệm).

Thành phần pha động

xác định sau khi cột có

được lựa chọn. Nó là cơ bản một hỗn hợp

dung môi bao gồm nước hoặc đệm

trộn với một dung môi hữu cơ. Các

ba yếu tố chính ảnh hưởng đến

tách được (1) loại hữu cơ

dung môi, (2) tỷ lệ dung môi hữu cơ, và độ pH (3) của bộ đệm

giải pháp. Acetonitrile và methanol là hữu cơ được sử dụng phổ biến nhất

dung môi (điểm (1)). Acetonitrile là các dung môi hữu cơ được ưa chuộng nhất

HPLC phân tích. Acetonitrile cung cấp những lợi ích kép của hiệu ứng tiếng ồn thấp

do hấp thụ tia cực tím thấp của nó và cuộc sống cột mở rộng, vì nó cho phép

phân tích ở áp suất thấp. Tuy nhiên, trong trường hợp đặc biệt, methanol có thể

được lựa chọn do tính chọn lọc cao của nó. Methanol được chọn nếu đỉnh A và

B có thể được tách ra bằng cách sử dụng methanol nhưng không sử dụng acetonitrile, hoặc nếu đỉnh

A và B riêng biệt dễ dàng trong cả hai dung môi nhưng giá trị (tỷ lệ giá trị k ')

A và B là lớn hơn cho acetonitrile, phân tích như vậy có thể được hoàn thành vào

một thời gian ngắn hơn bằng cách sử dụng methanol.

Tỷ lệ dung môi hữu cơ (điểm (2)) được chọn là tỷ lệ

đạt được sự tách biệt cần thiết và nhanh nhất đạt được rửa giải.

(Tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ đạt được nhanh hơn

rửa giải. Giảm tỷ lệ rửa giải chậm hơn nhưng tốt hơn

chia ly.) Khi chỉ có các chất trung tính được phân tích, giữ lại

thời gian là không bị ảnh hưởng bởi độ pH giai đoạn di động, để phân tích đó là bình thường

thực hiện bằng cách sử dụng nước và các dung môi hữu cơ. Trong trường hợp này, chỉ có điều kiện

(1) và (2) cần phải được thiết lập. Tuy nhiên, điều kiện (3) cũng phải được thiết lập khi

phân tích các chất có tính axit hoặc cơ bản.

Ví dụ, axit benzoic tồn tại trong các ion solut ở bang

trạng thái cân bằng thể hiện trong hình. 2. Rơi pH của giải pháp đẩy

cân bằng về phía bên phải, tăng tỷ trọng của không tích điện

nhà nước. Ngược lại, tăng độ pH giải pháp làm tăng các điện ly

nhà nước (bên trái). Trạng thái không tích điện tốt hơn là giữ lại trong

đảo ngược pha sắc ký: làm giảm độ pH tăng sự giữ lại

lực lượng, tăng độ pH đạt được rửa giải nhanh hơn. Ngược lại, đối với cơ bản

chất như amin, tăng độ pH tăng giữ lại

hiệu lực. Phương pháp thiết lập độ pH dựa trên nhận thức về độ pH này

phụ thuộc vào gia tăng lực lượng duy trì trong khi ức chế sự phân ly

được gọi là "phương pháp ion đàn áp." Khi axit và các căn cứ bị ảnh hưởng

độ pH của giai đoạn điện thoại di động, một bộ đệm phải được sử dụng thay vì nước

đảm bảo lặp lại phân tích. Để kiểm soát tách, độ pH giai đoạn di động

có thể được thay đổi để đạt được tách chọn lọc của axit và bazơ

các chất khác.

Bộ đệm thường được chuẩn bị bằng cách hòa tan một yếu tính axit hoặc yếu

cơ bản muối trong nước. Các bộ đệm thường được sử dụng là axit phosphoric, acetic

axit, axit boric, acid citric, và amoni. Các bộ đệm được chọn

theo pKa của nó, như một bộ đệm trưng bày năng lực đệm mạnh nhất ở

độ pH tương tự như các pKa axit yếu được sử dụng (hoặc pKa của acid liên hợp

một nhóm cơ sở yếu). Giả sử rằng độ pH đệm mục tiêu là 4,8, ví dụ.

Khi pKa 4.8 axit axetic là rất gần với độ pH đệm mục tiêu,

một bộ đệm acid acetic là mong muốn. Tuy nhiên, một axit axetic hoặc citric acid

đệm là không thích hợp cho các phép đo với một máy dò hấp thụ tia cực tím

ở các bước sóng ngắn gần 210 nm, như là nền tảng tăng do

hấp thụ của nhóm carboxyl nếu axit axetic, axit citric được sử dụng.

Thiết lập điều kiện (3) yêu cầu thông tin về các tính chất của hóa học

hợp chất và sự chú ý đến các điểm mô tả ở trên để thiết lập một độ pH

đạt được tách từ các chất khác trong thời gian tối thiểu có thể.

Đảo ngược pha sắc ký

Trong bài viết này, chúng tôi thảo luận đảo ngược pha sắc ký ion cặp

(RP-IPC), mở rộng phạm vi ứng dụng của RPC.

IPC đã được phát triển từ một phương pháp tách chiết dung môi được gọi là

khai thác cặp ion. Các phương pháp khai thác cặp ion liên quan đến việc khai thác

một lớp dung môi hữu cơ sau khi áp dụng các ion truy cập ngược lại

phí cho một chất ion trong dung dịch nước để tạo thành các cặp ion

trung hòa phí tổng thể. Silica gel được sử dụng trong các ứng dụng ban đầu

của IPC để HPLC nhưng bây giờ hầu hết các IPC được thực hiện bằng cách sử dụng RPC. Các

tính năng cơ bản của RPC là làm tăng lưu giữ như là cực mẫu

giảm. Như đã thảo luận trong các vấn đề trước đó, khi phân tích một ion

chất sử dụng RPC, giữ lại phụ thuộc vào trạng thái phân ly:

duy trì được tăng cường trong tiểu bang undissociated.

Do đó, thêm các ion truy cập đến một chất ion để tạo thành ion

cặp làm giảm sự phân cực và làm gia tăng lực lượng giữ lại. Hãy xem xét

ví dụ về phân tích của thiamine (vitamin B1). Thiamine là một mạnh mẽ

cơ bản chất chứa nitơ bậc bốn trong phân tử của nó và

thường mang điện tích dương trong một giai đoạn điện thoại di động. Do đó, nó đi

trực tiếp thông qua giai đoạn hydrocarbon vững chắc của việc đóng gói RPC mà không cần

trải qua một tương tác kỵ lẫn nhau. Tích điện âm

octanesulfonic ion axit thêm vào các cặp giai đoạn ion hình thức điện thoại di động với

thiamine, do đó làm giảm phân cực của nó như vậy mà nó được giữ lại.

pha rắn. Đó là, thuốc thử cặp ion (ion truy cập) trung gian giữa

không cực rắn giai đoạn và các mẫu ion.

RP-IPC thực tế duy trì cơ chế có thể không thực hành được đầy đủ

giải thích bằng cách sử dụng mô hình đơn giản ở trên. Ba mô hình có sẵn,

đầu tiên trong số đó là "cặp ion mô hình" đã được giải thích ở trên.

Tiếp theo là "mô hình thay thế ion, trong đó các bộ phận không cực của

thuốc thử ion cặp ban đầu được hấp phụ trên bao bì để tạo thành một ion

thay thế bề mặt mà giữ lại các mẫu bằng cách thay thế ion. Cuối cùng,

chúng tôi có mô hình tương tác ion ", trong đó có một phạm vi rộng lớn hơn của

ứng dụng hơn so với "mô hình ion cặp" và "mô hình ion thay thế."

xem xét các mô hình cân bằng năng động, bao gồm các ảnh hưởng của không

lực tĩnh điện nhưng cũng là giai đoạn điện thoại di động hấp dẫn và đẩy

lực lượng và các lực lượng pha rắn hút và đẩy. Mặc dù một số

hiện tượng được quan sát thấy rằng không thể được giải thích bằng các mô hình này và

các mô hình khác cũng có sẵn để xem xét, các mô hình sẽ không được

thảo luận thêm ở đây.

Một muối sulfonate alkyl như sulfonate sodium 1-pentane hoặc natri

sulfonate có chỉ số octan thường được sử dụng như thuốc thử cặp ion cho cơ bản

chất, như mô tả trong ví dụ phân tích thiamine. Tetraalkyl

ion amoni như hydroxit amoni tetrabutyl thường được sử dụng

là thuốc thử ion cặp cho các chất có tính axit. Tất cả các thuốc thử

dễ dàng có thể đạt được từ các nhà sản xuất thuốc thử. Gần đây, rất tinh tế

độ tinh khiết cao ion cặp thuốc thử cho các ứng dụng HPLC đã xuất hiện trên

thị trường. Với bình thường RPC, RP-IPC lưu giữ mẫu là bị ảnh hưởng

bởi số lượng của dung môi hữu cơ trong giai đoạn điện thoại di động, nồng độ

của bộ đệm, và độ pH. Tuy nhiên, lưu giữ mẫu RP-IPC cũng

bị ảnh hưởng bởi các loại và nồng độ của thuốc thử cặp ion. Nói chung,

còn là alkyl dây chuyền của thuốc thử cặp ion và cao hơn các

tập trung (lên đến một mức nhất định), lớn hơn mẫu duy trì

hiệu lực. Giảm trong lực lượng duy trì (foldover) được quan sát thấy khi các ion

cặp nồng độ tinh khiết đạt đến một giới hạn nhất định.

Hai điểm khác phải được xem xét khi sử dụng RP-IPC. Thứ nhất, phải mất

một số thời gian cho cột để hoàn toàn ổn định từ thời điểm đó

thuốc thử cặp ion bắt đầu chảy vào cột. Đôi khi, việc lưu giữ

thời gian sẽ không ổn định nếu mẫu được tiêm sau khi thời gian cần thiết để

đạt được trạng thái cân bằng với một giai đoạn bình thường của điện thoại di động RPC. Điều quan trọng là

kiên nhẫn chờ đợi cho cột đầy đủ ổn định. Thứ hai, nước

không được sử dụng ngay lập tức tuôn ra những thuốc thử cặp ion ra khỏi cột

(Đặc biệt là thuốc thử một cặp ion cơ bản như các ion amoni tetraalkyl). Nếu

cột được rửa bằng nước thay vì giải pháp bộ đệm, các tetrabutyl

ion amoni, trong đó có các vùng kỵ nước, có thể vẫn hấp thụ

trên bao bì và nguyên nhân gây ra sự suy giảm của silica gel. Trong trường hợp này,

quan trọng là để tuôn ra thuốc thử cặp ion bằng cách sử dụng một hỗn hợp của có tính axit

bộ đệm và dung môi hữu cơ với một tỷ lệ giữa 1:1 và 1:2.

RP-IPC là một kỹ thuật mạnh mẽ mà rất nhiều mở rộng phạm vi của

ứng dụng của RPC, và do đó, HPLC. Chúng tôi hy vọng rằng mới

ứng dụng cho nó sẽ được phát triển trong tương lai.

Đảo ngược-Ion giai đoạn đôi

Sắc ký

Những tiến bộ trong HPLC và ứng dụng rộng rãi của nó mang lại nhu cầu

tách và định lượng dấu vết của các thành phần mục tiêu nhỏ hơn bao giờ hết

trong mẫu ngày càng phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp đặc biệt được yêu cầu

cho loại phân tích này, vì nó có thể được khó khăn để thực hiện bằng cách sử dụng bình thường

HPLC dò. Một cách tiếp cận là derivatization, trong đó tăng cường

phát hiện độ nhạy và độ chọn lọc cho các thành phần mục tiêu. Nhiều

thuốc thử đặc biệt và kỹ thuật đã được phát triển để cải thiện

derivatization. Trong bài này, chúng ta sẽ thảo luận về derivatization chung

phương pháp được sử dụng trong HPLC.

Hai phương pháp der ivat izat ion được sử dụng trong HPLC: trước cột

derivatization và derivatization cột. Sự khác biệt giữa

phương pháp này là phản ứng derivatization xảy ra trước khi cột

với phương pháp cột trước và sau khi cột với cột bài

phương pháp. Các tính năng của từng phương pháp được thảo luận dưới đây.

a)-cột derivatization

Pre-ion derivat cột izat thường được tiến hành off-l ine. Khi

derivatization phản ứng diễn ra bên ngoài hệ thống sắc ký,

phương pháp trước cột cung cấp những lợi thế sau đây trong bài viết

cột phương pháp:

1) cấu hình thiết bị đơn giản;

2) không có hạn chế về các điều kiện phản ứng: thời gian phản ứng, phản ứng

nhiệt độ, số lượng của chất phản ứng, vv;

3) khối lượng nhỏ thuốc thử derivatization sử dụng, cho phép sử dụng

đắt tiền thuốc thử;

4) derivatization thuốc thử có thể được tách ra từ derivatization

sản phẩm và không có ảnh hưởng đến tính chính xác định lượng hoặc

giới hạn phát hiện trong trường hợp nơi mà các nhiếp chính derivatization có thể được

phát hiện (ví dụ, thuốc thử phản ứng có photoabsorbance

ở 400 nm và sản phẩm phản ứng cũng có photoabsorbance tại

400 nm);

5) derivatization thường cho phép lựa chọn dễ dàng tách

điều kiện hơn so với các thành phần ban đầu.

Trong khi các phương pháp trước cột cung cấp sự tự do đáng kể trong việc lựa chọn

phản ứng, các điều kiện sau đây phải được đáp ứng để đạt được chính xác

định lượng:

1) phản ứng khả năng tái xuất sắc;

2) sản phẩm phản ứng ổn định theo thời gian;

3) các sản phẩm phụ đỉnh không ảnh hưởng với các đỉnh núi mục tiêu.

Các nhà sản xuất thuốc thử thị trường thuốc thử rất nhiều cột

derivatization phản ứng với các nhóm như nhóm cacboxyl, amino

nhóm, và nhóm hydroxyl.

b) Post-cột derivatization

Khi các phương pháp sau cột tiến hành trực tuyến derivatization, nó cung cấp

lợi thế hơn các phương pháp trước cột sau đây:

1) quá trình phản ứng tự động cho phép hoạt động không cần giám sát;

2) xử lý các sản phẩm phản ứng thời gian không ổn định như thời gian phản ứng có thể

được chính xác điều khiển bởi flowrates của bơm giai đoạn điện thoại di động

và bơm thuốc thử phản ứng;

3) cho phép phản ứng một phần.

Tuy nhiên, các phương pháp sau cột phải đáp ứng các điều kiện sau đây:

1) để tránh nền tăng, thuốc thử phản ứng của chính nó phải

không phát hiện được nó thay đổi thành một chất có thể phát hiện chỉ sau khi

phản ứng với các thành phần mục tiêu;

2) tách không phải hy sinh do những hạn chế trên điện thoại di động

giai đoạn yếu tố (pH, nồng độ dung môi hữu cơ, vv)

cải thiện điều kiện phản ứng;

3) lây lan trong những ban nhạc thành phần không được làm ảnh hưởng tách (trong

Nói cách khác, thời gian phản ứng ngắn).

Ví dụ về các phương pháp sau cột bao gồm các phân tích của amin

axit sử dụng o-phthalaldehyde (OPA) và giảm đường phân tích sử dụng

arginine.

Các phương pháp derivatization phải được lựa chọn theo mục tiêu của

phân tích, dựa trên một hiểu biết tốt về các tính năng nêu trên.

Nhu cầu về HPLC có thể trở nên rộng hơn và nghiêm trọng hơn

trong tương lai. Đáp ứng những nhu cầu sẽ đòi hỏi sự phát triển của

cuốn tiểu thuyết HPLC hệ thống kết hợp derivatization.

Derivatization trong HPLC

Đảo ngược pha sắc ký và

Kỵ nước Tương tác sắc ký

Việc tách protein và axit nucleic được xử lý thông thường

sắc ký lọc gel hoặc sắc ký trao đổi ion.

Gần đây, nghiên cứu đã được tiến hành vào tách bằng cách sử dụng đảo ngược-

giai đoạn sắc ký và sắc ký tương tác kỵ nước.

Nhờ có nhiều gel cứng mới dựa trên silica hóa học ngoại quan

gel đã được phát triển gần đây để đẩy nhanh đáng kể

tách biệt của các đại phân tử sinh học, vai trò của HPLC trong lĩnh vực này.

trở nên ngày càng quan trọng.

Tách các phương pháp khai thác sự tương tác kỵ nước giữa

protein và giai đoạn rắn bao gồm đảo ngược pha sắc ký

(RPC) và sắc ký tương tác kỵ nước (HIC). Các tính năng

của hai phương pháp này được mô tả dưới đây.

RPC có thông thường là dòng chính của HPLC được

sử dụng cho việc phân tích các chất trọng lượng phân tử thấp và có

được áp dụng gần đây để phân tích các axit nucleic và protein. Một

hóa học ngoại quan silica gel với một kích thước lỗ chân lông lớn được sử dụng như cột

đóng gói khi phân tích protein. Phương pháp gradient rửa giải được sử dụng

cho các điều kiện giai đoạn điện thoại di động, với số lượng dung môi hữu cơ

tăng độ pH từ 2 đến 3 hoặc độ pH trung tính gần. Là mẫu protein thường

biến tính trong quá trình này, phương pháp này một cách chính xác hơn nên được

được gọi là phân tích polypeptide.

Ngược lại, HIC sử dụng bao bì đó là kỵ nước ít hơn so với RPC

đóng gói và sử dụng Gradient rửa giải, trong đó muối nồng độ

giảm dần. HIC thường cho phép phân tích các protein mà không cần

phá hủy cấu trúc bậc cao của họ, như là không có dung môi hữu cơ được sử dụng

trong giai đoạn điện thoại di động, không giống như RPC. Do đó, phương pháp này nên được

áp dụng để tách dự bị.

Bây giờ chúng ta so sánh các bao bì được sử dụng trong các phương pháp này. Chính

loại bao bì cho RPC hóa học ngoại quan gel silica với một lỗ lớn

kích thước của ít nhất 30 nm (so với 8 đến 10 nm thường nhỏ

kích thước lỗ chân lông). Điều này đóng gói có một nhóm alkyl nhúng được cho là đã

một mẫu tỷ lệ phục hồi tốt. Silanol nhóm còn lại trong các hóa học

silica gel ngoại quan ảnh hưởng đến việc thu hồi các mẫu protein và

số tiền của nhóm silanol còn lại khác nhau tùy theo nhà sản xuất

và sản xuất rất nhiều, chẳng hạn cân nhắc số lượng hiện đang

khó khăn để thực hiện.

Silica thường có khoảng 8μmol/m2

silanol nhóm. Trong

tổng hợp đóng gói RPC bình thường, một đại lý silanol-khớp nối có chứa

alkyl nhóm phản ứng với các nhóm silanol. Số lượng các silanol

nhóm phản ứng với các đại lý là từ 3 đến 4μmol/m2

, Mặc dù nó phụ thuộc vào

chiều dài của chuỗi alkyl nhóm.

Để làm giảm tác dụng của các nhóm còn lại silanol trong sắc ký,

silylation thứ hai là thường được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc thử như

trimethylchlorosilane. Vấn đề với biến tính và tỷ lệ phục hồi

xảy ra khi đóng gói RPC được sử dụng cho phân tích protein vì

dung môi hữu cơ phải được sử dụng như giai đoạn điện thoại di động, như mô tả

ở trên. Do đó, RPC là chủ yếu được sử dụng để phân tích polypeptide

tương đối thấp trọng lượng phân tử. Một ví dụ được biết đến là phân tích

polypeptide thu được bằng cách tiêu hóa của protein bởi một enzyme như vậy

như trypsin.

HIC thường sử dụng bao bì được tạo ra bằng cách nhúng các nhóm kỵ nước,

chẳng hạn như các nhóm và các nhóm alkyl phenol, vào một gel thấm nước được sử dụng

sắc ký lọc gel. Tuy nhiên, lượng nhúng

nhóm kỵ nước là thấp hơn đáng kể hơn cho RPC. Silica-dựa và

polymer dựa trên bao bì HIC thương mại hiện đang có sẵn. Các

silica-dựa trên bao bì được thiết kế bởi các nhà sản xuất để loại bỏ

tác động của nhóm còn lại silanol. Các triển lãm bao bì RPC và HIC

một sự khác biệt lớn trong mức độ sợ nước, mà kết quả trong

sự khác biệt đáng kể trong điều kiện rửa giải được mô tả ở trên.

RPC là cấp trên HIC trong tách mẫu, trong khi kết quả HIC trong

thấp hơn mẫu biến tính. Khi cả hai HIC và RPC được dự kiến ​​sẽ đóng một

vai trò quan trọng cho việc phân tích các protein và axit nucleic trong tương lai,

việc lựa chọn cẩn thận các kỹ thuật thích hợp sẽ được essential.8

Silica gel Trên cơ sở đóng gói

Octadecylsi lylated (ODS) và lý hóa chất khác ngoại quan, xốp,

gel silica cầu hiện đang được sử dụng rộng rãi như bao bì trong HPLC

cột. Nhiều người đã tiến hành HPLC phân tích có

vấn đề có thể có kinh nghiệm với sự khác biệt giữa các cột

rất nhiều sản xuất hoặc có thắc mắc về sự khác biệt với ODS

cột sản xuất bởi các nhà sản xuất khác nhau. Bài viết này nhằm mục đích

làm rõ một số các truy vấn này về bao bì dựa trên silica gel.

Mục đích chung ODS silica gel thường được sản xuất bởi phản ứng

hình cầu, xốp silica gel có 5μm kích thước hạt trung bình và 6 đến

10 nm lỗ kích thước trung bình với một đại lý silanol-khớp nối như dimethyl-

octadecylchlorosilane. Khoảng 8μmol/m2

nhóm silanol vẫn còn

trên bề mặt silica gel, nhưng phản ứng với các khớp nối silanol-

đại lý nhúng các nhóm octadecyl thông qua trái phiếu siloxane. Tuy nhiên, khi

bằng cách sử dụng một nhóm thay thế cồng kềnh như dimethyl-octadecylsilyl

nhóm, nhóm unreacted silanol luôn luôn vẫn do trở ngại steric.

Số lượng của các nhóm silanol unreacted phụ thuộc vào phản ứng

điều kiện, nhưng xung quanh 5μmol/m2

silica ODS bình thường. Do đó,

nỗ lực đã được thực hiện để tiến hành silylation của nhóm silanol còn lại

bằng cách sử dụng một đại lý silanol-khớp nối với một nhóm thay thế với steric thấp

trở ngại. Đây là cái gọi là "trung silylation", trong đó sử dụng

trimethylchlorosilane (TMS-CI) hoặc các chất khác. Thương mại hiện đại

ODS silica gel được điều trị bằng TMS theo cách này (Hình 1). Còn lại

nhóm silanol ảnh hưởng đến hấp phụ mẫu cơ bản nhưng số tiền

các nhóm còn lại silanol khác từ nhà sản xuất để nhà sản xuất.

Vì vậy, sự chú ý đặc biệt cần thiết trong quá trình phân tích cơ bản

mẫu.

Bây giờ chúng ta xem xét kỹ hơn tại silica ODS gel. Khi "hình cầu silica

gel được quan sát dưới kính hiển vi, các hạt vỡ của silica gel

thường quan sát thấy pha trộn với nó. Ngoài ra, mặc dù hạt 5μm danh nghĩa

kích thước, rất nhiều các hạt dưới đây hạt 2μm và lớn về 10μm

cũng được bao gồm. Chênh lệch về kích thước hạt khác nhau theo

nhà sản xuất, và nó đã ảnh hưởng xấu đến trạng thái của cột

đóng gói. Hầu hết khách hàng có thể mua các cột đóng gói. Nếu một khoảng cách

xảy ra ở đầu vào cột sau một thời gian ngắn sử dụng, có thể có

vấn đề với cột đóng gói do sự khác biệt kích thước hạt.

Silica gel với một kích thước 10 nm lỗ danh nghĩa trung bình có một lỗ rỗng nhất định

phân phối kích thước và kích thước của sự phân bố lỗ rỗng kích thước thay đổi từ

nhà sản xuất. Một đại lý nối silanol cồng kềnh, chẳng hạn như

ODS, không phân tán trong một gel tốt mải mê nghiên cứu silica, như vậy mà số lượng

nhúng ODS giảm và trong một số trường hợp vẫn còn dư silanol

nhóm mà không cần trải qua silylation thứ. Do đó, lỗ chân lông

kiểm soát kích thước phân phối là cần thiết để loại bỏ sự khác biệt giữa

rất nhiều sản xuất trong sản xuất bao bì. Nói chung, như các lỗ chân lông trung bình

tăng kích thước, silica gel cụ thể giảm diện tích bề mặt, kết quả trong một

giảm trong số lượng rõ ràng của ODS nhúng và duy trì yếu

các chất có trọng lượng phân tử thấp. Cái gọi là "rộng lỗ chân lông" silica gel

với kích thước lỗ chân lông của 30 nm hoặc nhiều hơn gần đây đã được áp dụng cho các

phân tích của các đại phân tử, đặc biệt là protein và axit nucleic. Điều này

là bởi vì kết quả đóng gói lớn hơn kích thước lỗ chân lông phân tán nhanh chóng của một

mẫu phân tử trong và xung quanh các lỗ chân lông.

Sử dụng các loại đại lý silylation khác nhau của giấy phép sản xuất của

octyl, phenyl, cyanopropyl (CN), và aminopropyl (NH2) các loại

hóa học ngoại quan silica gel đóng gói, trong Ngoài ra để ODS. Việc đóng gói

phải được lựa chọn theo mục đích của phân tích. Những bao bì

có thể được sử dụng trong một phạm vi pH 2-8, silica các hòa tan trong kiềm

phạm vi và các giai đoạn hóa học ngoại quan rắn tách ra ở một độ pH dưới

2 do sự phân tách của trái phiếu Si-C. Cột với polymer phủ

silica gel và cột với các nhóm octadecyl nhúng vào một tổng hợp

bề mặt polymer được sử dụng để cải thiện khả năng chống kiềm. Tuy nhiên,

hóa học ngoại quan cột silica gel là những ngày này được sử dụng rộng rãi là

giá rẻ, bền, hiệu suất cao đóng gói.

Absorptiometric phát hiện

Hấp thu là một phương pháp phát hiện rằng các biện pháp hấp thụ

dựa trên sự kích thích của các electron hóa trị trong các phân tử. Đó là

phương pháp phát hiện sử dụng rộng rãi nhất cho HPLC vì nó cung cấp tuyệt vời

tổng quát, chọn lọc tuyệt vời, và dễ dàng xử lý tốt.

Hấp thụ (A) được định nghĩa là logarit tiêu cực của tỷ lệ

cường độ ánh sáng truyền qua (I) cường độ ánh sáng tới (Io)

đơn sắc ánh sáng đi qua một r chiều dài con đường ánh sáng trong một dung môi. Nó

mang mối quan hệ sau đây với C nồng độ chất phân tích:

Một εCr =

, Ε là sự hấp thụ phân tử của chất phân tích.

Mối quan hệ này, nơi hấp thụ là tỷ lệ thuận với nồng độ,

được biết đến như bia của Luật. Nó áp dụng khi sự tương tác giữa

chất phân tích có thể được bỏ qua và tình trạng hóa học chất phân tích không phụ thuộc

vào nồng độ. Với HPLC, phân tích các thành phần mục tiêu mà

elute từ cột có nồng độ pha loãng, như vậy mà Luật Bia

áp dụng và được sử dụng như một hàm tuyến tính đối với tập trung thành phần

trong quá trình định lượng.

Vì vậy, chúng ta hãy xem xét những chất này có thể được phân tích bằng cách hấp thu

và những gì các điều kiện đo lường được. Khi σ điện tử, π

điện tử, và n điện tử (không-liên kết) trong phân tử

kích thích bởi ánh sáng, họ trải qua quá trình chuyển đổi từ liên kết hoặc nonbonding

quỹ đạo để các quỹ đạo antibonding. (An quỹ đạo antibonding được ký hiệu là

một dấu *.) Như σ -> σ * quá trình chuyển đổi đòi hỏi cao hơn đáng kể

năng lượng hơn so với quá trình chuyển đổi các hợp chất khác, với chỉ duy nhất trái phiếu,

chẳng hạn như các hydrocacbon bão hòa, không thể được phát hiện trong 190 đến 700 nm

phạm vi bước sóng bằng phương pháp này phát hiện. Các hợp chất với các electron n

và trái phiếu bị cô lập π triển lãm hấp thụ trong phạm vi tia cực tím do

n -> π *, n -> σ *, hoặc chuyển tiếp π -> π * nhưng sự hấp thụ phân tử

nói chung là nhỏ. Do đó, trong thực tế, chất mục tiêu được giới hạn

hệ thống liên hợp. Tuy nhiên, nhiều chất xử lý bởi HPLC

là những hệ thống liên hợp, phát hiện sự hấp thụ trắc học là thường

được sử dụng.

Các bước sóng đo lường t ing là một điểm quan trọng là

xác định độ nhạy phát hiện và chọn lọc. Nếu nhiều tạp chất

các thành phần tồn tại, bước sóng có thể được lựa chọn để làm giảm của họ

ảnh hưởng, nhưng bước sóng đo lường thường được thiết lập.

bước sóng hấp thụ tối đa các thành phần mục tiêu phân tích. Điều này

không phải là chỉ để có được độ nhạy cao nhất nhưng cũng để loại bỏ ảnh hưởng của

thiết lập lỗi trên bước sóng nhạy cảm. Độ hấp thụ tối đa

bước sóng được xác định bằng cách đo quang phổ hấp thụ với một

quang phổ. Đối với một cấu trúc polyene đơn giản hoặc cấu trúc enone,

bước sóng hấp thụ tối đa có thể được tính bằng cách sử dụng các Woodward

và quy tắc Fieser. Tính toán này liên quan đến các giá trị thêm áp dụng cho các

bộ xương cơ bản và các nhóm ngoại quan chức năng. Một ví dụ này

tính cho một enone steroid, chẳng hạn như một khoáng chất steroid, được thể hiện dưới đây.

Phương pháp này được mô tả trong sách giáo khoa hóa học hữu cơ rằng

xử lý quang phổ. Hãy tham khảo sách giáo khoa cho chi tiết hơn

thông tin.

Quang phổ hấp thụ và sự hấp thụ phân tử được điều chỉnh bởi

cấu trúc hóa học, nhưng trong dung dịch thay đổi do để solvation,

tương tác với chất thứ ba, và nhà nước không liên. Những

thay đổi đặc biệt lớn khi các nhóm không liên

liên hợp hệ thống. Ví dụ, hấp thụ tối đa

bước sóng của anilin và sự hấp thụ phân tử tại bước sóng này

thay đổi như sau.

Do đó, điều kiện điện thoại di động giai đoạn tối ưu phải được điều tra

để phát hiện cũng như để tách. Anilin, điện thoại di động

giai đoạn pH cao hơn so với pKa anilin là cao điểm của

xem của cả hai độ nhạy và tính chọn lọc. Đối với loại chất mà

triển lãm thay đổi đáng kể trong hấp thụ do tình trạng không liên,

lặp lại và độ tuyến tính có thể thu được bằng cách sử dụng một bộ đệm để

duy trì một mức độ liên tục của sự phân ly.

Giai đoạn di động là một yếu tố quan trọng đối với loại hình này phát hiện,

nó ảnh hưởng đến tình trạng hóa học của các thành phần mục tiêu. Ngoài ra, nó

quan trọng là phải xem xét độ hấp thụ của giai đoạn di động chính nó. Đối với

Ví dụ, làm tăng tiếng ồn và những đỉnh núi hệ thống có thể xuất hiện nếu điện thoại di động

giai đoạn có chứa một chất có độ hấp thụ cao. Điều này cũng có thể gây ra

biến động cơ bản trong quá trình rửa giải Gradient. Lý tưởng nhất, một giai đoạn điện thoại di động

thấp hấp thụ ở bước sóng đo được lựa chọn.

Wi thứ dr ama tic inc rease in t rument pe r formanc điện tử,

hấp thu có thể phát hiện một số thành phần ở các cấp độ pmol nếu tối ưu

điều kiện thiết lập. Nó là một công cụ mạnh để phân tích phần tử theo dõi nếu

hấp thụ của chất được biết đến.

Mối quan hệ sắc ký

Chất sinh học, chẳng hạn như các enzym và nhiều chất hoặc kháng nguyên

kháng thể, có tài sản của chọn lọc công nhận mỗi

khác để hình thành các phức. Mối quan hệ sắc ký là một sự tách biệt và

thanh lọc phương pháp khai thác mối quan hệ sinh học này. Ví dụ, một

enzym đặc biệt có thể được chiết xuất từ ​​một ma trận có chứa một cực kỳ

cao của các thành phần bằng cách sử dụng một chất là phối tử

tang vật cụ thể mối quan hệ cho các enzyme mục tiêu, chẳng hạn như tương ứng của nó

chất nền hoặc chất ức chế.

˙ Thủ tục Affinity sắc ký

Thủ tục bao gồm bốn bước sau đây:

(1) cân bằng cột

Cột được làm đầy với một đóng gói vào một ligand thích hợp

bất động. Cột sau đó được equilibrated với dung môi

sẽ được sử dụng cho mẫu hấp phụ.

(2) Ngoài ra mẫu và hấp phụ các chất mục tiêu (Hình a)

Mẫu được đưa vào các cột và các thành phần mục tiêu

hấp phụ trên bao bì.

(3) Cột rửa (Hình b)

Giặt được thực hiện để loại bỏ các thành phần không hấp thụ vào

đóng gói từ cột.

(4) rửa giải của các thành phần mục tiêu (Hình c)

Một dung môi được đưa vào cột để elute các thành phần mục tiêu

hấp phụ trên bao bì để phục hồi các thành phần mục tiêu. Các

thủ tục sau đó lại bước (1).

Về nguyên tắc, mối quan hệ sắc ký có hiệu quả có thể trích xuất một mục tiêu

thành phần từ một ma trận phức tạp có chứa nhiều thành phần

chỉ sử dụng hoạt động đơn giản.

˙ phối tử Lựa chọn và cố định trên bao bì các

Việc lựa chọn các phối tử và đóng gói ma trận và phương pháp để cố định

phối tử phải được xem xét cẩn thận trước khi tiến hành mối quan hệ thực tế

sắc ký.

• Lựa chọn các phối tử

Rửa giải từ cột có thể được khó khăn nếu các mối quan hệ giữa

chất sử dụng như là các phối tử và các thành phần mục tiêu là quá mạnh. Nếu

phối tử nhiều có thể được xem xét, lựa chọn các chất trong đó cung cấp

chọn lọc lớn nhất cho các hợp chất mục tiêu và giấy phép rửa giải

từ cột theo các điều kiện vừa phải nhất.

• Lựa chọn các ma trận

Các ma trận thường được sử dụng là agarose và ưa nước tổng hợp

đại phân tử (polyvinyl alcohol, polyacrylate, vv) hạt. Trong

nguyên tắc, một ma trận được chọn đó là không hoạt động đối với mẫu

và là vật lý và hóa học ổn định theo các điều kiện được sử dụng. Nó

cũng phải lưu ý rằng nếu các hạt xốp, phân phối lỗ chân lông của họ

và cụ thể diện tích bề mặt ảnh hưởng đến lượng phối tử bất động và

lượng hiệu quả của phối tử trên bề mặt bao bì.

• immobilizing các phối tử

Phương pháp CNBr và kỹ thuật khác để cố định các phối tử

đã được báo cáo. Một phương pháp phối tử cố định phải được lựa chọn

cho phép các chức năng hiệu quả của khu vực trưng bày mối quan hệ

cho các thành phần mục tiêu. Chiều dài của spacer giữa phối tử

và ma trận cũng rất quan trọng, đặc biệt là nếu các thành phần mục tiêu là một

đại phân tử như protein. Nhiều loại của ma trận hoạt động

cho phép dễ dàng phối tử bất động thương mại.

· Ứng dụng Ví dụ

Nhiều trường hợp tách và tinh chế bởi mối quan hệ sắc ký

đã được báo cáo. Tách lectin đường như phối tử

và phân tách các thụ thể nội tiết tố bằng cách sử dụng một ma trận hormone ràng buộc

đã được báo cáo là ví dụ về sự tách biệt của protein

một l immobi ized igand l trọng lượng phân tử thấp. Ví dụ sử dụng một

chất đại phân tử như phối tử bao gồm việc tách

calmodulin-bị ràng buộc protein bằng cách sử dụng ma trận bất động calmodulin và

tách fibronectin sử dụng collagen là phối tử.

Nhiều trường hợp thanh lọc enzyme đã được báo cáo. Tuy nhiên, nếu

bề mặt được sử dụng như một phối tử cẩn thận, kiểm soát của sắc ký

điều kiện cần thiết để ngăn chặn các enzyme phá vỡ các phối tử.

Kháng nguyên hoặc kháng thể được sử dụng rộng rãi như các phối tử để cô lập một cụ thể

kháng thể hoặc kháng nguyên. Trong trường hợp này, mối quan hệ cực kỳ mạnh mẽ giữa

kháng nguyên và kháng thể yêu cầu các biện pháp như giảm eluate

độ pH hoặc sử dụng một tác nhân biến tính hoặc các ion chaotropic.

Mối quan hệ sắc ký thường trình bày những bất lợi mà người sử dụng

đã làm cho hấp thụ. Mặc dù vậy, kỹ thuật này là khả năng tiếp tục

được sử dụng như là một cách thuận tiện và hiệu quả để cô lập các thành phần mục tiêu.

Đảo ngược pha sắc ký hiện đang được sử dụng phổ biến nhất

HPLC tách chế độ, trong khi bình thường pha sắc ký

được sử dụng trong phạm vi chỉ giới hạn các ứng dụng. Sự khác biệt kết quả từ

nhiều lợi thế của đảo ngược pha sắc ký, bao gồm cả của nó

mở rộng ứng dụng trước đây khó khăn để phân tích các hợp chất như vậy

ion thành phần, nhờ sự phát triển của giai đoạn ion ngược

cặp sắc ký, và dễ dàng hoạt động, di động dựa trên nước

giai đoạn có thể được sử dụng. Tuy nhiên, giai đoạn sắc ký bình thường cung cấp

các thuộc tính khác nhau từ chế độ tách khác, bao gồm cả đảo ngược-

giai đoạn sắc ký, và có thể cực kỳ hiệu quả ive cho một số

mục đích.

˙-pha sắc ký bình thường là gì?

Định nghĩa ban đầu của giai đoạn sắc ký bình thường mà nó là một

loại sắc ký phân vùng, trong đó sự phân cực của các pha rắn

là cao hơn so với sự phân cực của giai đoạn di động. Ngoài ra, hấp phụ

sắc ký, được phân loại như là một chế độ gọi là tách

"Sắc ký lỏng rắn", bây giờ là được coi là giai đoạn bình thường

sắc ký. Trong hầu hết trường hợp, pha rắn được sử dụng cho giai đoạn bình thường

sắc ký là một cột không được điều trị silica gel xốp (SIL cột)

hoặc một cột có chứa silica gel hóa học ngoại quan tại bề mặt

nhóm chức năng cực, chẳng hạn như nhóm aminopropyl (NH2 cột)

hoặc cyanopropyl nhóm (CN cột). Giai đoạn di động được sử dụng thường

ethanol hoặc một dung môi cực thêm vào một dung môi không cực như

n-hexan. Tuy nhiên, một giai đoạn nước có chứa điện thoại di động đôi khi

được sử dụng để phân tích các thành phần cao cực. Việc tách

mỗi thành phần khác theo tỷ lệ phân phối giữa

pha rắn và giai đoạn di động. Sự tương tác giữa chất rắn

giai đoạn và mục tiêu thành phần sắc ký trong giai đoạn bình thường

chủ yếu là ưa nước tương tác, chẳng hạn như sự tương tác liên kết hydro

điện tương tác. Do đó, sắc ký giai đoạn bình thường

thường cung cấp chọn lọc tách khác nhau để đảo ngược pha

sắc ký, trong đó chủ yếu là liên quan đến tương tác kỵ nước.

-Sắc ký giai đoạn bình thường là được sử dụng cho?

Giai đoạn sắc ký bình thường có thể dễ dàng tách các đồng phân tocopherol

rất khó để tách sắc ký pha đảo ngược và

đường rất khó để giữ lại bằng cách đảo ngược pha sắc ký. Nó

elute với nhau tất cả các thành phần khác nhau với độ dài chuỗi alkyl

ngành trong phân tích của alkyl benzen sulfonate. Các tính chất này

phát sinh như các khu vực liên quan đến việc duy trì các hợp chất khác nhau từ những người trong

sắc ký pha đảo ngược, như mô tả ở trên. Ngoài ra, như là

giai đoạn điện thoại di động sử dụng cho giai đoạn sắc ký bình thường thường có

không có nước, kỹ thuật này là lý tưởng cho việc tách dễ dàng thủy phân

các hợp chất, chẳng hạn như axit anhydrit, tập trung sau khi fractioning;

chuẩn bị ly thân và thanh lọc đòi hỏi khô. Bình thường

giai đoạn sắc ký cũng có thể được thuận lợi từ quan điểm

năng suất lượng tử để phát hiện huỳnh quang, sự hấp thụ phân tử và

phát hiện bước sóng trong việc phát hiện sự hấp thụ.

˙ Đầu tư ion igat vào ion Separat sử dụng bình thường, giai đoạn

Sắc ký

Wi thứ bình thường pha sắc ký, tăng mobi le giai đoạn

phân cực thường làm tăng tốc độ rửa giải. Ví dụ, nếu một / n-hexan

hỗn hợp ethanol được sử dụng như giai đoạn điện thoại di động, rửa giải xảy ra nhanh hơn nếu

tỷ lệ ethanol, trong đó có phân cực cao hơn, được tăng lên.

Chăm sóc là cần thiết, vì điều này là mối quan hệ đảo ngược để đảo ngược pha

sắc ký, trong đó tỷ lệ elut ion tăng lên khi

điện thoại di động cực giai đoạn giảm. Sử dụng một độ nhớt thấp dung môi trong

giai đoạn điện thoại di động đôi khi cho phép các tốc độ chảy cao và cột nhanh chóng

cân bằng. Nếu một cột NH2, CN cột được sử dụng, một số điện thoại di động

Kết quả giai đoạn sáng tác trong phân cực ngược của giai đoạn điện thoại di động

và rắn giai đoạn, như vậy mà các chức năng cột như là một giai đoạn đảo ngược

sắc ký cột. Vì vậy, điều quan trọng là phải nhận thức được

khả năng rằng các hành vi rửa giải có thể biến động dữ dội, đặc biệt là nếu một

giai đoạn điện thoại di động với một tỷ lệ cao của nước được sử dụng.

Kết luận

Bình thường pha sắc ký là một kỹ thuật tách quan trọng đối với

một số phân tích. Nó có thể sẽ tiếp tục được sử dụng cho một phạm vi giới hạn của

mục đích.

Bình thường-pha sắc ký

Tầm quan trọng của kiểm soát chất lượng phát triển quốc tế, là điển hình

Series tiêu chuẩn ISO-9000 và GLP / GMP dược phẩm. Các

xác nhận của các công cụ và các biện pháp phân tích yêu cầu như là một

phương pháp khách quan xác minh các công cụ phân tích và độ tin cậy dữ liệu

trong một loạt các ngành công nghiệp. Một kiểm tra độ chính xác, tức là, mức độ

sự khác biệt trong kết quả phân tích, là một trong những mục trong phương pháp xác nhận

và hệ thống phù hợp xét nghiệm được tiến hành trong quá trình xác nhận. Điều này

bài viết khám phá RSD (CV), được sử dụng để thể hiện chính xác.

Khi ghi, hiển thị dữ liệu phân tích, nếu chỉ có một dữ liệu điểm

được thu thập, giá trị được sử dụng trực tiếp, nếu dữ liệu nhiều điểm

thu thập, giá trị trung bình hoặc giá trị trung bình thường được sử dụng như thống kê

đặc điểm. Tuy nhiên, khi sự khác biệt tồn tại trong các dữ liệu,

tình trạng chính xác của dữ liệu có thể không được chính xác thể hiện bởi những

chỉ số ist ical characterist ics một mình. Trong băng pract, dữ liệu không bao giờ phù hợp

hoàn hảo từ phân tích để phân tích và kết quả khác biệt một. RSD

(CV) thường được sử dụng như là một chỉ số khách quan trong phân tích thống kê

sự khác biệt như vậy. Trong Bảng 1 dưới đây, các giá trị trung bình là 100 cho cả hai

Kết quả (1) và kết quả (2), nhưng sự khác biệt trong kết quả từ (2) là

rõ ràng là lớn. Sản lượng tính RSD RSD = 2,92% Kết quả (1)

và RSD = 29,2% Kết quả (2).

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và Hệ số biến thiên (CV)

là đồng nghĩa. Những giá trị này được sử dụng để khách quan thể hiện các dữ liệu

sự khác biệt (chính xác). Nó được định nghĩa là độ lệch chuẩn (SD)

chia trung bình (x

-

), Như thể hiện trong biểu thức dưới đây. Đối với

mức độ tự do của độ lệch tiêu chuẩn (tử số bên trong

vuông gốc), (n-1) thường được sử dụng thay vì n (số lượng dữ liệu). Điều này

là bởi vì một đặc tính thống kê để ước tính dân số được sử dụng

thay vì toàn bộ dữ liệu dân số.

Độ lệch chuẩn (SD) thường được tính bằng cách sử dụng biểu thức (2)

hoặc (3).

Bảng 2 cho thấy một ví dụ của một ion RSD calculat (CV). Điều này

tính có thể dễ dàng xử lý bằng cách sử dụng một máy tính hoặc bảng tính.

Số dữ liệu n (số phân tích lặp đi lặp lại) được xác định

theo mức độ của sự khác biệt dữ liệu và khó khăn trong

có được dữ liệu. Hội nghị quốc tế về Hài hòa hóa

(ICH) hướng dẫn mang tên "Văn bản Xác nhận của Thủ tục phân tích"

(1997) đề nghị sử dụng một trong hai thủ tục sau đây

đánh giá độ chính xác:

a) lặp lại tất cả các hoạt động cần thiết cho phương pháp phân tích ít nhất chín

lần bao gồm phạm vi tập trung quy định (ví dụ, lặp lại

tất cả các hoạt động ba lần mỗi ba nồng độ);

b) lặp lại tất cả các hoạt động cần thiết cho các phương pháp phân tích ít nhất là sáu lần

100% nồng độ thử nghiệm.

Shimadzu LCsolut ion Workstat ion cho HPLC lý ical automat

tính toán và hiển thị độ lệch chuẩn và RSD giữ

thời gian và các giá trị khu vực.

Nói chung, độ chính xác duy trì thời gian kiểm tra trên một sản lượng hệ thống HPLC

thông tin để đánh giá sự ổn định (1) tốc độ dòng chảy (bơm tốc độ ổn định;

kiểm tra van hoạt động ổn định và rò rỉ), (2) hiệu suất cột,

(3) Gradient chính xác, (4) giai đoạn ổn định điện thoại di động, (5) nhiệt độ môi trường xung quanh

biến động, và (6) tắc nghẽn dòng chảy. Một kiểm tra về giá trị khu vực

hoặc nồng độ chính xác cung cấp thông tin để đánh giá (1) tiêm

tính chính xác, (2) ổn định phát hiện, và sự ổn định phản ứng (3) (trước hoặc

hệ thống phản ứng sau cột) .14

Bài viết này bàn về các yếu tố tailing và độ phân giải xuất hiện trong

mục đặc trưng trong phương pháp xác nhận và kiểm tra hệ thống phù hợp.

1. Yếu tố Tailing (Tf)

Yếu tố Tailing (Tf) là một chỉ số thể hiện sự đối xứng của các

đỉnh eluted cá nhân. Đó là đôi khi được gọi là "yếu tố đối xứng."

Lý tưởng nhất, đỉnh sắc ký đối xứng (Tf = 1), nhưng có thể

không đối xứng do một số yếu tố, phần lớn trong số đó là

sau:

(1) thứ hấp phụ của các thành phần mẫu trong cột;

(2) tình trạng (không tính thống nhất, ô nhiễm) của bề mặt cột (rắn

giai đoạn);

(3) tập trung quá mức hoặc độ nhớt của các thành phần mẫu;

(4) tốc độ dòng chảy quá mức hoặc điều kiện phân tích khác không phù hợp;

(5) cột đóng gói không đồng nhất;

(6) không gian chết hoặc kênh trong cột;

(7) chết không gian trong dòng chảy như phun hoặc ống dẫn;

(8) gradient nhiệt độ bất thường hoặc trong cột.

Một phương pháp để xác định liệu bất đối xứng i ty của các đỉnh

bắt nguồn từ hệ thống hoặc là cố hữu trong các thành phần (phân tích

điều kiện) để phân tích một thành phần với sự tương tác thấp và so sánh

tailing yếu tố. Ví dụ, naphthalene hoặc este benzoate được sử dụng

đảo ngược pha sắc ký.

Ở đâu,

a0.05 là chiều rộng của mặt trước của đỉnh (bắt đầu điểm đến đỉnh) ở mức 5% cao điểm

chiều cao vị trí và W0.05h là chiều rộng đỉnh cao ở vị trí cao điểm chiều cao 5%.

Nói chung, nếu Tf <1, đỉnh được mô tả là "hàng đầu" hoặc "fronting"; nếu

Tf> 1, đỉnh được mô tả như "tailing". Một loạt các giá trị từ 0,5 đến

1,5 là bình thường thích hợp. Nếu Tf nằm ngoài phạm vi này, nguyên nhân

được điều tra. Bằng cách tham khảo, phù hợp mục trong hệ thống

FDA phản biện Hướng dẫn

3

) Nói rằng Tf <2 là mong muốn.

2. Nghị quyết

Độ phân giải (Rs) là một chỉ số về mức độ tách biệt giữa hai

các thành phần. Nó được định nghĩa là sự khác biệt trong thời gian lưu giữ giữa hai

đỉnh núi, chia cho chiều rộng cao điểm có nghĩa là. Giống như số lượng lý thuyết

tấm, resolut ion được định nghĩa sl lý ight lý khác nhau ở Nhật Bản

Pharmacopoeia1

) Và Hoa Kỳ Dược điển 2

), Áp dụng chiều rộng cao điểm

một nửa chiều cao phương pháp và phương pháp tiếp tuyến chiều rộng đỉnh cao, tương ứng.

1) Nhật Bản Dược điển

Ở đâu,

TR1 là thời gian lưu giữ của các đỉnh cao phía trước;

tR2 là thời gian duy trì đỉnh cao sau;

W0.5h1 là chiều rộng đỉnh cao phía trước ở vị trí 50% chiều cao đỉnh điểm;

W0.5h2 là chiều rộng đỉnh phía sau ở vị trí 50% chiều cao đỉnh.

2) USP

Ở đâu,

W1 là chiều rộng đỉnh cao của đỉnh cao phía trước *;

W2 là chiều rộng đỉnh cao của đỉnh cao phía sau *;

(* Lưu ý: Chiều rộng cao điểm được thực hiện như biên độ thời gian giữa hai

điểm giao nhau của đường cơ sở và các tiếp tuyến bên trái

và điểm uốn phải cao điểm.)

Giải thích GLP / GMP ngữ:

Tailing tố, Nghị quyết

Thông thường, Rs> = 1,5 chỉ ra được sự ngăn cách đã xảy ra (cơ bản

separat ion), do đó cung cấp các ion mong muốn điều kiện t rel iable

định lượng. Giá trị này là đặc biệt quan trọng đối với sắc ký,

là một trong những đặc trưng của sắc ký là khả năng của mình để thực hiện việc

đồng thời phân tích của nhiều thành phần.

Bằng cách tham khảo, phù hợp mục hệ thống trong phản biện của FDA

Hướng dẫn

3)

nói rằng "Rs> 2 là mong muốn giữa giá cao mục tiêu và

đỉnh liền kề gần nhất (tạp chất, pha loãng đại lý, thành phần tách biệt,

nội bộ tiêu chuẩn, vv). "

Trong một số trường hợp, hệ số tách (α, duy trì tương đối) cũng là

được sử dụng. Tách hệ số là tỷ lệ của các yếu tố công suất (k) của

hai đỉnh. Nó được định nghĩa như sau:

Ở đâu,

k'1 là giá trị của k (yếu tố năng lực) của đỉnh cao phía trước;

k'2 là giá trị của k (yếu tố năng lực) của đỉnh cao sau;

t0 là thời gian cao điểm unretained (thời gian chết);

TR1 là thời gian duy trì đỉnh cao phía trước, và

tR2 là thời gian lưu giữ của đỉnh cao sau.

Cột mỗi hiệu năng val idat ion funct ion của các Shimadzu

LCsolution Workstation cho HPLC có thể tự động tính toán

tailing yếu tố, độ phân giải, và hệ số tách bằng cách sử dụng Nhật Bản

Dược điển, USP, và phương pháp tính toán khác. Nếu tính toán

kết quả cho các tham số này không đáp ứng các tiêu chí vượt qua, vượt qua / không

đánh giá bằng cách sử dụng chức năng QA / QC có thể có những hành động như reinjection hoặc

dừng lại phân tích.

Tài liệu tham khảo

1. Nhật Bản Dược điển lần thứ 12

Edition, phương pháp thử chung (Liquid

Sắc ký)

2. USP (United States Pharmacopeia) XXIII-5, <621> sắc ký

3. Trung tâm Nghiên cứu và đánh giá thuốc (CDER FDA), Người phản biện

Hướng dẫn, tháng Mười (1994) "Xác nhận của phương pháp sắc ký"

4. LCtalk Vol. 34 tuổi, TEC "Tính toán của Số Tấm lý thuyết."

Đỉnh

Nhật Bản Dược điển, DB USP

Tailing yếu tố

Số

lý thuyết

Tách Tailing yếu tố

Số

lý thuyết

Tách

Một

1 1,41 15649 1,41 12701

2 1,28 20444 11,34 1,28 17558 10,34

3-20389 1,65 - 17.718 1,53

4 1,20 22245 8,47 1,20 20233 7,97

B

1 2,49 5972 2,49 5426

2-7917 7.02 - 7310 6,70

3 - - - - 5.371 0,90

4 1,71 9.957 1,71 9.316 4,91

Mẫu tính toán các yếu tố Tailing và Resolution16

Thông thường, "nhạy cảm" được sử dụng để thể hiện khả năng của một

phương pháp phân tích hoặc công cụ phân tích khi thảo luận về việc phát hiện

khả năng đối với số lượng của các chất. Độ nhạy là

thực sự là một thuật ngữ chỉ ra tầm quan trọng của phản ứng phát hiện với

tôn trọng với một số tiền của một thành phần trong một mẫu, và được chính xác,

Phát hiện giới hạn "hoặc" giới hạn định lượng "là một chỉ số về khả năng phát hiện.

Giới hạn phát hiện được định nghĩa là số lượng của một chất mà tạo ra

một tín hiệu khác đáng kể từ một trống. Tuy nhiên, "khác nhau

đáng kể "là không thực sự quy định tại tiêu chuẩn ISO hoặc trong JIS, và thiếu của một

thống nhất giải thích nguyên nhân sự nhầm lẫn trong việc xử lý các phát hiện "

giới hạn ".

Ở đây chúng ta wi sẽ giải thích defini t ion phát hiện ion l IMI t và i ts

phương pháp đo lường như được quy định bởi Hội nghị quốc tế ICH (

Hài hoà các yêu cầu kỹ thuật đối với đăng ký của

Icals Pharmaceut cho sử dụng con người), tổ chức với mục đích

giải thích hài hòa giữa Nhật Bản, Hoa Kỳ và

Liên minh châu Âu.

Theo ICH, giới hạn phát hiện được định nghĩa là "số tiền thấp nhất

chất phân tích trong một mẫu có thể được phát hiện nhưng không nhất thiết phải định lượng

như là một giá trị chính xác. "cụm từ" không nhất thiết phải định lượng như một chính xác

giá trị "có nghĩa là không có cần thiết cho một phép đi kèm

mức độ của sự thật và chính xác, khác với giới hạn định lượng trong

tôn trọng.

Phương pháp xác định giới hạn phát hiện khác nhau tùy thuộc vào

có hoặc không phải là phương pháp phân tích là một phương pháp cụ phân tích,

Tuy nhiên, nó có thể được phân loại rộng rãi vào 3 phương pháp sau đây.

(1) Phương pháp dựa trên đánh giá trực quan

Phương pháp này được sử dụng khi các phương pháp phân tích không phụ thuộc

trên một phương pháp cụ phân tích. Ở đây, một mẫu được biết đến

nồng độ pha loãng dần dần, và pha loãng các sân khấu lớn nhất tại

mà mẫu có thể được phân biệt với các trống được thực hiện như là

giới hạn phát hiện.

(2) Phương pháp dựa trên tín hiệu-to-noise

Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong sắc ký. Các tín hiệu chất phân tích

và tiếng ồn cơ bản được đo, và nồng độ chất phân tích

(Khối lượng) tại đó tỷ lệ 2:01 hay 3:01 thực hiện như là các giới hạn phát hiện.

Đầu tiên tập trung mẫu được điều chỉnh sao cho chiều cao đỉnh điểm là

ít nhất 10 lần so với tiếng ồn cơ bản, và sau đó đo lường

được tiến hành để có được chiều cao đỉnh cao h. (Châu Âu dược điển

Năm 1987)

Đối với tiếng ồn, hN biến động tối đa được đo trong một thời gian

khoảng thời gian 20 lần so với chiều rộng cao điểm tại một nửa chiều cao, và 1 / 2 đó

giá trị được thực hiện như là tiếng ồn N (Hình 1, dược điển Châu Âu-1987), hoặc

đường cơ sở được ghi trong 15 phút được chia thành 0,5 - 1 phút

phân đoạn (X1, X2, X3 ....), đường song song được rút ra trong chiều ngang

trục hướng phân cách bằng chiều rộng tối thiểu cần thiết để bao gồm

tiếng ồn trong mỗi phân khúc, khoảng cách thẳng đứng giữa

đường song song được tính toán (Y1, Y2, Y3 ....) dọc theo bộ phận phân khúc

đường, và giá trị trung bình thu được và đưa ra tiếng ồn trong N (Hình 2,

(3) Căn cứ vào độ lệch chuẩn của phản ứng và độ dốc của

hiệu chỉnh đường cong

Đây là một phương pháp trong đó một mẫu trống được phân tích và

độ lệch chuẩn là thu được, hoặc vài mẫu có chứa một

chất phân tích với nồng độ (khối lượng) gần với giới hạn phát hiện

được phân tích, độ lệch chuẩn còn lại của đường hồi qui

hoặc độ lệch tiêu chuẩn của các y-đánh chặn được xác định, và

giới hạn phát hiện được tính bằng cách sử dụng phương trình sau đây.

DL = 3.3σ / a

(Σ: độ lệch tiêu chuẩn của phản ứng

: độ dốc của đường cong hiệu chuẩn)

Điều này được gọi là giới hạn phát hiện Currie (LA Currie: IUPAC tạm thời

Dự thảo, 1994), trong đó giới hạn phát hiện là số lượng chất

tương ứng với tín hiệu tại các vị trí μB + 3,29 σB thu được từ

μB trung bình của phân phối tín hiệu trống (μB, σB). Nói cách khác,

tín hiệu phân phối N (ms, σB) khi xác suất của một lỗi của

đầu tiên loại xảy ra (xác suất sai quyết định rằng một tín hiệu được

hiện tại khi nó không phải) và xác suất của một lỗi thuộc loại thứ hai

xảy ra (xác suất sai quyết định rằng một tín hiệu không có mặt

khi nó được) đều là 5%.

HPLC, phương pháp xác định thường được sử dụng là một trong hai là dựa trên

tỷ lệ tín hiệu-to-tiếng ồn hoặc dựa trên độ lệch chuẩn của

phản ứng và độ dốc của đường cong hiệu chuẩn.

Phương pháp xác định dựa trên tín hiệu-to-noise dụng dễ dàng và là

được sử dụng phổ biến nhất, tuy nhiên, khi có cơ sở biến động

chẳng hạn như trong phân tích rửa giải gradient, hoặc khi có tạp chất gần đó

đỉnh núi, phương pháp này là không phù hợp. Mặc dù phương pháp dựa trên

độ lệch chuẩn của phản ứng và độ dốc của đường cong hiệu chuẩn

yêu cầu dữ liệu phong phú cho tính toán, nó có lợi thế là

áp dụng đối với mọi trường hợp.

Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn của phản ứng và độ dốc của

đường cong hiệu chuẩn được hiển thị dưới đây. Tuy nhiên, kể từ khi độ lệch chuẩn

trống không thể có được trong HPLC, đó là thu được từ các tiêu chuẩn

độ lệch của đường hồi qui (còn lại hoặc y-đánh chặn).

Lý thuyết Conc. 0,04% 0,06% 0,08% 0,10% 0,12%

1 chạy 3551 4446 6182 7963 9405

2 chạy 3282 5089 6294 8154 9226

3 chạy 3013 5050 6418 8078 9084

4 chạy 3635 4907 6793 7668 9780

5 chạy 3119 4686 6109 7525 9591

Bảng 1 Dữ liệu của mẫu Chứa chất phân tích tại Nồng độ được biết đến

w Giới hạn phát hiện: DL = 3.3sy / x / a = 0,011 (%)

(Độ lệch chuẩn còn lại:

sy / x = {Σ {yi - (axi + b)} 2

/ (N-2)} 1 / 2

= 252,857)

hoặc

w Giới hạn phát hiện: DL = 3.3sy / a = 0,013 (%)

(Y-đánh chặn độ lệch chuẩn:

sy = sy / x {1 +1 / n + (Σxi / n)

2

/ S (xi-Σxi / n)

2

} 1 / 2

= 294,879)

(A = 76182: hồi quy đường dốc,

b = 267,36: y-đánh chặn

n = 25: tổng số lần lặp lại phân tích)

Lưu ý rằng các tiêu chuẩn y-đánh chặn deviat ion calculat ion công thức

hiển thị ở trên đại diện cho sự phân bố của hồi quy phụ thuộc

biến (ngoại suy giá trị dự đoán) khi biến độc lập

(Lý thuyết tập trung) là 0. Có một phương trình riêng biệt cho

tính toán độ lệch tiêu chuẩn y-đánh chặn, tuy nhiên, nó nên được

chỉ ra rằng khi phương trình được sử dụng, một giá trị nhỏ hơn là thu được

• Giới thiệu

các thành phần.

Các

vô cùng khó khăn.

Nói cách khác

nguồn.

thông qua.

Trong trường hợp

ion hóa.

giao diện.

Điều này

phân tử.

giải pháp.

Hình

Hình

Kết cấu

ion.

phát hiện. Trong hình.

buồng.

n +

).

Hình

Ở đây chúng ta

cơ chế.

Các

Một

đường.

tách rời nhau.

Tuy nhiên,

Ngoài ra,

dễ dàng.

Kể từ khi

Trong trường hợp này,

Tách

tạp chất.

sạch sẽ.

giai đoạn.

phương pháp.

gặp rắc rối.

khách hàng.

Trong

Ngoài ra,

Kể từ khi

Những

Các

Các

1)

Hình

Mặc dù

giai đoạn.

phương pháp. Kết quả cho thấy

Hình 2

Hình

Hình

Hãy

Tự nhiên

Với

Điều này có nghĩa

Nó

ý thức. Ở đây chúng ta

Mặc dù

Hình

hệ thống.

clorua.

Hình

đỉnh núi.

Hình

dưới đây.

Trong

chia ly.

axit.

Tuy nhiên, kể từ khi

nhạy cảm.

nền.

Điều này

Hình

Hãy

Một

phân phối.

_

_

_

_

_

_

w.

_

_

vị trí.

giới hạn.

phạm vi.

Đóng gói

vật liệu

Hình

tách

Hình

Hình

3.

Mới! Nhấp vào các từ bên trên để xem các bản dịch thay thế. Loại bỏ

Từ điểnGoogle Dịch cho:Tìm kiếmVideoEmailĐiện thoạiTrò chuyệnDoanh nghiệp:Bộ công cụ DịchGlobal Market FinderWebsite Translator

Giới thiệu về Google DịchTắt dịch nhanhBảo mậtTrợ giúp