Câu 13: KT PCR là gì? Nêu rõ các thành phần tham gia P/ứng PCR?

1.     KT PCR:

        Kĩ thuaath PCR (p/ứng chuỗi trùng hợp- Polymerase Chain Reaction) là kt tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh, chính xác cao đc thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).

      Kĩ thuật PCR đc Karry Mullis phát minh năm 1985 và đc tiếp thu hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sx đc enzyme ADN polymerase chịu nhiệt từ VK Thermophilus aquaticus và 1 số VK khác. Sự khuếch đại bằng PCR đc th/hiện in vitro trong 1 ống nghiệm plastic nhỏ (ependoff), khác hẳn với sự tạo dòng các đoạn ADN in vitro đc gắn vào plasmid của TB VK hoặc nấm men. K/thuật này đc ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đv sự p/triển của S/học p/tử và KT DT.

·        Nguyên lý:

KT tổng hợp ADN ngoài cỏ thể cũng tuân thủ những ng/tắc cơ bản của sao chép ADN trong cơ thể như: Đoạn ADN cần nhân mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần ng/liều và đk M/trường thích hợp và enzyme polymerase. Tuy nhiên ở KT PCR ng/ta dùng nhiệt độ cao (94oc) để tháo xoắn thay cho helicase kết hợp enzyme ADN polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn p/ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi đc thiết kế chủ động. Nhờ kt PCR mà với 1 lượng nhỏ ADN ban đầu ch/ta có thể thu đc đủ lượng ADN cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về ADN.

2.     Các cấu phần tham gia p/ứng PCR:

        Muốn tiến hành p/ứng PCR cần có các thành phần như sau:

-         ADN khuôn

-         Các oligonucleotide primer (mồi).

-         Polymerase chịu nhiệt (taq polymerase).

-         dNTP.

-         Dung dịch đệm.

·        / ADN khuôn ( DNA template): đóng vai trò rất quan trọng trong kt PCR. Đoạn khuôn có thể là ADN mạch kép, mạch đơn hoặc ARN. Hàm lượng khuôn ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR. Lượng ADN genome ban đầu  dùng cho p/ứng PCR khoảng 1µg, thậm chí về lí thuyết, kt PCR chỉ cần 1 phân tử ADN là đủ và cũng ko cần pải tách đoạn ADN cần nhân ra khỏi hỗn hợp ADN genome.

·        Các oligonucleotide primer (mồi) hay primer: Việc lựa chọn primer rất quan trọng cho 1p/ư PCR. Đoạn mồi cần có k/thước hợp lí, từ 18-25 nucleotide, có trình tự b/sung với trình tự 2 đầu mạch khuôn. Mồi càng dài khả năng tổng hợp ADN mới càng chính xác. Ngược lại, khi mồi ngắn quá sự bắt cặp giữa mồi và khuôn không thuận lợi nên k/quả PCR kém độ chính xác.Có 2 loại mồi là mồi xuôi (forward primer, ki hiệu là F), và mòi ngược (reverse primer, K/H là R) tham gia p/ư PCR.

-         Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’ ---> 3’, mồi ngược bắt cặp b/sung gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’--> 5’. Mồi a/hưởng rất nhiều đến hiệu quả  của p/ư PCR, để đảm bảo h/quả p/ư PCR cần chọn các nồi xuôi và mồi ngược có các trình tự ko b/sung với nhau, tránh x/ra h/tượng bắt cặp giữa các mồi, có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần giống nhau. Nếu biết trình tự của các đoạn gen cần khếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer t/ứng để th/hiện PCR và tách chúng ra bằng kt điện di. Hiệu quả PCR cao khi có mồi phù hợp với khuôn và khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược ko quá 1kb.

·        Polymerase chịu nhiệt (taq polymerase): Đc tách chiết từ chủng VK suối nước nóng Thermophilus aquaticus. taq polymerase có hoạt tính chịu nhiệt độ cao, nhiệt độ tối ưu là 72oC và tương đối bền vững ở nhiệt độ biến tính ADN (92-94oC) làm cho p/ư PCR x/ra nhanh, chính xác và đặc hiệu.

·        dNTP: Các loại nucleotide triphosphate. dNTPs thường dùng ở nòng độ 10 mM (2,5 mM mỗi loại) đc b/quản ở -20oC. Hàm lượng của các dNTP trong khoảng 20-200 μm cho k/quả ổn định, chính xác và đặc hiệu. 4 loại dNTP đc sd cần có n/độ tương đương nhau để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó.

·        Dung dịch đệm: Buffer thích hợp và MgCl2. Nồng độ của Mg2+ có thể a/hưởng đến nhiệt độ biến tính ADN khuôn mẫu, quá trình ủ của các primer, tính đặc hiệu của sp PCR, hoạt tính của taq pol và độ chính xác của k/quả. Nồng độ thích hợp của Mg2+ là từ 0,5-2,5 nM ứng với n/độ của dNPT tổng số đã cho. Nồng độ của Mg2+ cao sẽ làm cho p/tử ADN sợi đôi ổn định hơn và ngăn ngừa đc sự biến chất hoàn toàn (mở xoắn để giải phóng sợi đơn của sp PCR trong mỗi chu kỳ) làm cho k/quả PCR nghèo đi. Mặt khác nó còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả (tại những vị trí ko tương đồng) ổn định hơn dẫm đến x/hiện những sp PCR không đặc hiệu với số lượng khá lớn. Ngược lại, nếu Nồng độ của Mg2+ quá thấp sẽ ảnh hưởng xấu đến qt tổng hợp ADN, Do đó, cần pải xác định Nồng độ tối ưu của Mg2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sp PCR.