1

CÔNG NGHỆ ENZYME

(Enzyme technology

Technologie des enzymes

Enzymtechnologie)

Người trình bày:

Bùi Văn Ngọc

Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm

KH&CN Việt Nam

Email: [email protected] hoặc [email protected]

Hà Nội, tháng 8 năm 2016

Chương 4: Enzyme cố định (immobilized enzymes)

4.1 Giới thiệu về enzyme cố định

4.2 Các phương pháp điều chế enzyme cố định

4.3 Tính chất của enzyme cố định

4.4 Các bioreactor chứa enzyme cố định

4.5 Sử dụng enzyme cố định trong công nghiệp thực phẩm

4.1 Giới thiệu về enzyme cố định

•  Khái niệm: enzyme cố định (enzyme không tan) là enzyme

được định vị vật lý vào một hoặc vài vùng xác định trên chất

mang mà vẫn giữ được hoạt tính và có thể tái sử dụng nhiều

lần. Nói cách khác, là enzyme được gắn lên các chất mang

không hoà tan hoặc chúng được gắn với nhau bằng liên kết

đồng hoá trị tạo nên đại phân tử enzyme không hoà tan

•  Ưu điểm của enzyme cố định:

-  Tái sử dụng nhiều lần

-  Không tan lẫn vào sản phẩm, có thể tách khỏi cơ chất khi dừng phản ứng, không ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị sản phẩm

-  Bền với nhiệt độ, pH, dung môi hữu cơ

•  Nhược điểm của enzyme cố định:

-  Hạn chế sự chuyển khối giữa 2 pha

-  Không hiệu quả đối với cơ chất rắn

4.2 Các phương pháp điều chế enzyme cố định

•  Có 3 phương pháp: Hấp phụ (adsorption), gói hay bọc

(entrapment, encapsulation), và gắn bằng liên kết đồng hoá trị

(covalent binding) hoặc

•  Có hai phương pháp: Vật lý và hoá học

Điều chế

enzyme cố

định

Phương pháp

Phương pháp

vật lý

hoá học

Gói (bẫy)

Gói trong bao

Liên kết đồng

Liên kết chéo

Hấp phụ

trong khuôn

nang (bao vi

hoá trị với giá

giữa các phân

gel

thể)

thể không tan

tử enzyme

Các phương pháp điều chế enzyme cố định

Cố định enzyme

Gói (bẫy) trong Gói (bọc) trong

khuôn gel

bao vi nang (bao

vi thể)

Hấp phụ lên

Liên kết đồng hoá trị

Liên kết chéo

chất mang

với chất mang

Các chất mang (support) sử dụng để cố định enzyme

•  Chất mang thường sử dụng để cố định

enzyme bằng phương pháp hấp phụ

(nhờ lực van der Waals) có thể là:

-  Vô cơ: silic, thuỷ tinh xốp, oxyt kim loại...

-  Hữu cơ: than hoạt tính, cel ulose, dextran,

agarose...

•  Các chất mang sử dụng để cố định enzyme theo phương

pháp gắn enzyme bằng liên kết đồng hoá trị là:

-  Các polymer hữu cơ: polypeptide, polysaccharide (dextran, agarose)

-  Các chất vô cơ: silicagel, bentonite, nhôm hydroxide

-  Các dẫn xuất của cel ulose: DEAE-cel ulose, DEAE-sephadex, CM-

sephadex

-  Các polymer tổng hợp: polyacrylamide, polystyrol, polyamide, polyvinyl

Yêu cầu của chất mang

•  Hoà tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học, hoá

và sinh học

•  Không gây ức chế hoạt động của enzyme

•  Không hấp phụ phi chọn lọc đối với các protein khác

•  Mang điện tích trái dấu với enzyme

Sự hình thành liên kết đồng hoá trị giữa chất mang và

protein enzyme

•  Chất mang thường tạo liên kết đồng hoá trị với các nhóm

chức của amino acid thuộc phân tử protein enzyme như:

nhóm –COOH (aspartic acid, glutamic acid), –NH2 (lysine,

arginine), –SH (cystein), –OH (serine), nhân idole

(tryptophan), nhân imidazole (histidine)

(xem lại Bảng phân loại các amino acid trang 27, chương 1)

Sự hình thành liên kết đồng hoá trị giữa chất mang và

protein enzyme (tiếp)

•  Diazo hoá:

Chất mang–N = N–Enzyme

•  Tạo cầu amide:

Chất mang–CO = NH–Enzyme

•  Alkyl hoá và aryl hoá:

Chất mang–CH2 = NH2–Enzyme

•  Tạo schiff base:

Chất mang–CH = N–Enzyme

•  Trao đổi thiol-disulfide:

Chất mang–S – S–Enzyme

(xem lại Bảng phân loại các amino acid trang 27, chương 1)

Gel sử dụng để gói enzyme

•  Gel có thể được điều chế từ polyacrylamide

để tạo gel dạng chất nền (matrix)

•  Gel có thể là cel ulose triacetate, col agen,

chitosan tạo gel dạng sợi (fiber)

Gói enzyme trong bao vi thể (microcapsule)

•  Gel có thể được điều chế từ

polyethyleneimine (PEI) để tạo màng

bán thấm, màng này có kích thước lỗ

đủ nhỏ để enzyme không khuếch tán

ra ngoài và đủ lớn để cơ chất đi qua

trong qúa trình phản ứng

Gắn các enzyme với nhau bằng liên kết đồng hoá trị (cross-linking)

•  Là qúa trình tạo liên kết chéo đồng hoá

trị giữa các phân tử enzyme tạo thành

cấu trúc đại phân tử mà không cần đến

các chất mang. Tác nhân gắn thường

là glutaraldehyde với tỷ lệ 10% (w/w)

so với enzyme

So sánh các phương pháp cố định enzyme

Đặc điểm

Phương

Phương

Phương

Phương

pháp hấp

pháp gói

pháp gói

pháp liên

phụ

trong khuôn trong bao vi kết đồng

gel

thể

hoá trị

Phương pháp điều chế

Đơn giản

Phức tạp

Đơn giản

Phức tạp

Chi phí

Thấp

Vừa phải

Cao

Cao

Lực cố định

Thay đổi

Yếu

Mạnh

Mạnh

Hiện tượng nhả enzyme

Có

Có

Không

Không

Sự cố khi tiến hành

Cao

Cao

Cao

Thấp

Ảnh hưởng của chất mang Có

Có

Không

Có

Cản trở khuếch tán

Không

Có

Có

Không

Khả năng áp dụng

Rộng rãi

Rộng rãi

Rất rộng rãi

Chọn lọc

4.3 Tính chất của enzyme cố định

•  Enzyme cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng của

enzyme tự do là do một số nguyên nhân sau (???):

-  Khi enzyme gắn vào chất mang, dưới tác động của điện tích cấu hình không gian của enzyme sẽ bị thay đổi, ảnh hưởng đến TTHĐ và khả

năng xúc tác cuả enzyme

-  Khi enzyme được gói trong khuôn gel (chất nền, sợi) hoặc bao vi thể, các cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không tiếp xúc được với

enzyme, do đó hoạt lực của enzyme cũng giảm

-  Khi các phân tử enzyme liên kết với nhau tạo thành đại phân tử, qúa trình tương tác protein-protein giữa các enzyme có thể làm biến dạng cấu hình không gian của từng phân tử enzyme đơn lẻ, qua đó cũng

ảnh hưởng đến TTHĐ và khả năng xúc tác của enzyme nói chung

4.3 Tính chất của enzyme cố định (tiếp)

•  Hằng số động học của enzyme cố định tuân theo động học

Michaelis Menten. Tuy nhiên cũng có những sai khác:

-  Ảnh hưởng đến giá trị Km (ái lực enzyme–cơ chất): Việc cố định enzyme lên chất mang gây cản trở cơ chất tiếp xúc với TTHĐ của enzyme, giảm ái lực enzyme và cơ chất (giá trị Km?), do đó làm giảm vận tốc phản ứng (v)

-  Ngoài ra, hoạt độ xúc tác của enzyme cũng bị ảnh hưởng bởi tốc độ

khuếch tán của cơ chất (S) và sản phẩm (P). Tốc độ khuếch tán lại phụ

thuộc vào kích thước lỗ gel hoặc bao vi nang, khối lượng phân tử của cơ

chất và sản phẩm tạo thành

•  Enzyme cố định có tính bền nhiệt cao hơn enzyme tự do

•  pH tối ưu của enzyme cố định thường bị chuyển sang miền

kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme tự do (?? Phụ

thuộc vào trường tĩnh điện của chất mang)

•  Enzyme cố đính có thời gian bảo quản lâu hơn và bền với các

tác nhân kìm hãm và biến tính hơn enzyme tự do (??)

14

4.4 Thiết bị phản ứng (Bioreactor)của enzyme cố định

Là nơi diễn ra các phản ứng chuyển hoá các hợp chất (cơ chất)

thông qua qúa trình xúc tác enzyme. Thiết bị phản ứng enzyme

được lựa chọn tuỳ thuộc vào đặc điểm của từng phản ứng và mục

đích sử dụng

•  Thiết bị phản ứng liên tục

•  Thiết bị phản ứng enzyme dạng màng

•  Thiết bị phản ứng dạng cột

•  Thiết bị phản ứng tầng sôi

15

•  Thiết bị phản ứng liên tục (continuous flow reactor)

-  Cấu trúc như thiết bị gián đoạn, nhưng được

vận hành liên tục với vận tốc dòng cơ chất

(feeding pump) vào thiết bị bằng với vận tốc

dòng sản phẩm và cơ chất (chưa được

chuyển hoá hết) ra khỏi thiết bị (effluent).

Thường sử dụng hệ thống thiết bị nối tiếp

nhau (?)

-  Thời gian lưu trung bình của cơ chất: V/F,

trong đó V là thể tích của thiết bị, F là vận tốc

dòng cơ chất (?)

-  Thích hợp khi vận hành với enzyme cố định

-  Ưu điểm: Năng suất làm việc lớn hơn thiết bị

gián đoạn khi sử dụng cùng 1 lượng enzyme.

Cho phép sử dụng cơ chất có độ hoà tan

thấp, phản ứng enzyme không đổi trong suốt

qúa trình

-  Nhược điểm: Chi phí nhiều hơn (nhiều bình

phản ứng nối tiếp nhau). Chỉ sử dụng cho

qúa trình có vận tốc chuyển hoá thấp (?)

16

•  Thiết bị phản ứng enzyme dạng màng (membrane reactor –

MR)

-  Được trang bị một màng bán thấm chỉ cho phép sản phẩm đi qua mà ngăn không cho enzyme đi qua. Màng thường dùng là màng cel ophane chứa

các sợi nhỏ có đường kính 200 µm, độ dày 50 µm.

-  Thiết bị này có thể hoạt động gián đoạn hoặc liên tục, có thể dùng cho enzyme dạng tự do (hình trái) hoặc enzyme cố định (hình phải). Trong trường hợp cơ chất không khuếch tán qua màn (?) hoặc có thể khuếch tán qua màng, thì cơ chất và enzyme nên bố trí như thế nào?

-  Ưu điểm: Thích hợp với quy mô nhỏ, dễ dàng thay thế enzyme (khi enzyme không bền)

-  Nhược điểm: Thay thế màng định kỳ, giá thành màng thường cao

17

•  Thiết bị phản ứng dạng cột (packed bed reactor)

-  Có dạng hình trụ, được lấp đầy chất mang có gắn enzyme (cố định)

-  Cơ chất (substrate, reactants, inlet) chảy qua khối enzyme cố định theo chiều từ dưới lên song song với trục dọc của thiết bị và không bị khuấy trộn ngược.

-  Ưu điểm: Cơ chất được tiếp xúc đều với enzyme, thời gian lưu như nhau

-  Nhược điểm: Lớp lọc dễ bị bịt kín do sự tạo keo hoặc do qúa trình liên kết, kết tủa của cơ chất, dẫn đến khó kiểm soát nhiệt, pH. Khó thu hồi enzyme sau phản ứng

18

•  Thiết bị tầng sôi (Fluidized Bed Reactor):

-  Là dạng trung gian giữa thiết bị dạng cột và thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn. Bao gồm một lớp hạt enzyme cố định được thổi ngược lên phía trên nhờ

dòng cơ chất (feed) hoặc/và kết hợp với dòng khí (air, nitrogen, oxy), do đó các hạt enzyme luôn giữ ở trạng thái lơ lửng nhờ dòng cơ chất hoặc/và dòng khí (trạng thái sôi)

-  Ưu điểm: Phù hợp với sản phẩm dạng khí, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất

-  Nhược điểm: Kích thước và mật độ hạt enzyme cần đủ lớn để không bị rửa trôi khỏi thiết bị. Không thích hợp với vận tốc dòng lớn. Khó khăn khi nâng cấp thiết bị, do đặc tính thuỷ lực dòng chảy thay đổi khi thay đổi kích thước thiết bị

4.5 Ứng dụng của enzyme cố định

•  Trong y học:

-  Điều trị các bệnh thiếu hệ enzyme (tiêu hoá): Sử dụng enzyme

gói trong bao vi thể để tránh sự phá huỷ bởi các protease của cơ

thể (do phản ứng miễn dịch của cơ thể)

-  Điều trị bệnh bạch cầu: Gói L-asparaginase trong bao vi thể

(microcapsule) để thuỷ phân L-asparagin (??)

-  Làm tan các cục máu đông gây tác nghẽn động mạch bằng

streptokinase... hoặc

-  Loại urea trong máu trong chạy thận nhân tạo bằng urokinase

gói trong bao vi thể

(Tham khảo thêm "Công nghệ enzyme" của Đặng Thị Thu,

2012, trang 67-90)

4.5 Ứng dụng của enzyme cố định (tiếp)

•  Trong công nghệ hoá học, thực phẩm, dược phẩm: Tổng hợp

các chất dinh dưỡng, dược liệu, kháng sinh...

Enzyme cố định

Sản phẩm

Aminoacylase

L-amino acid

Aspartate amonialyase

L-aspartic acid

Aspartate decarboxylase

L-alanine

Glucoamylase

D-glucose

Gluco-isomerase

Siro nồng độ fructose cao

Invertase

Đường nghịch đảo

Lactase (ß-galactosidase)

Sữa không có lactose

Raffinase

Đường không có raffinose

Penicil ium amidase

Penicil in

21

Kết thúc chương 4