1

CÔNG NGHỆ ENZYME

(Enzyme technology

Technologie des enzymes

Enzymtechnologie)

Người trình bày:

Bùi Văn Ngọc

Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm

KH&CN Việt Nam

Email: [email protected] hoặc [email protected]

Hà Nội, tháng 8 năm 2016

2

Chương 2: Sản xuất chế phẩm enzyme từ vi sinh

vật

2.1. Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

2.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.4. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

2.5. Thiết bị lên men

2.6. Thu hồi chế phẩm enzyme

3

2.1. Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

•  Phân lập và tuyển chọn: Từ đất, nước, không khí, động vật,

thực vật, mẫu bệnh phẩm...hoặc từ bộ sưu tập giống vi sinh

vật (ngân hàng) của đơn vị nghiên cứu nhằm tuyển chọn

được chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển

nhanh, sinh tổng hợp enzyme cao, ổn định

Phân lập, tuyển chọn

vi sinh vật từ bộ sưu

tập giống

4

Phân lập, tuyển chọn vi

sinh vật từ môi trường

(phương pháp truyền

thống và công nghệ

metagenomics)

5

2.2. Cải tạo giống vi sinh vật

•  Do cấu trúc, tính chất, chức năng của mỗi protein enzyme

đều được xác định bởi bộ máy di truyền trong tế bào vi sinh

vật (DNA, RNA, protein). Vì vậy, cải biến (qúa trình đột biến)

bộ máy di truyền của vi sinh vật sẽ tạo ra các biến chủng vi

sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cao một loại biến thể

protein enzyme có hoạt độ cao hơn thế hệ trước (kiểu dại,

wild type). Có hai phương pháp chính tạo đột biến:

-  Đột biến bằng các tác nhân vật lý (tia cực tím UV, tia Rơnghen, bắn phá electron...), hoá học (nitrozol methylguanin, methyl dicloro

methylamin)

-  Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử (công nghệ gen, DNA tái tổ hợp)

6

Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử

(công nghệ gen, DNA tái tổ hợp)

•  Phương pháp biến nạp (transformation): Là quá trình chuyển

vật liệu di truyền (DNA lạ) từ môi trường hoặc từ sinh vật

khác (không cần tiếp xúc) qua màng tế bào vi sinh vật nhận

7

•  Phương pháp tiếp hợp gen (conjugation): Vật liệu di truyền

(DNA) được truyền từ tế bàp cho đến tế bào nhận thông qua

sự tiếp xúc

8

•  Phương pháp tải nạp (transduction): Vật liệu di truyền

được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận thông qua

vật chủ trung gian (virus, thực khuẩn thể)

9

2.2. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Mục đích: Kéo dài tuổi thọ và ổn định di truyền vi sinh vật

•  Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật được cấy truyền trên môi trường rắn (môi trường thạch) thích hợp (LB, YPD...), bảo quản ở 4ºC, qúa trình lặp lại từ 2 tuần -2 tháng tuỳ từng vi sinh vật (đảm bảo vi sinh vật được chuyển đến môi trường mới trước khi già hoặc chết)

10

Cấy truyền trên môi trường thạch

Môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm

Môi trường thạch trong đĩa petri

11

Ưu và nhược điểm của phương pháp cấy

truyền trên môi trường thạch

•  Ưu điểm: đơn giản, dễ thao tác, ít tốn kém

•  Nhược điểm: Tốn nhiều công sức cấy truyền, dễ bị tạp nhiễm,

dễ mất chủng gốc, đột biến chủng gốc (thay đổi đặc điểm sinh

học)

12

•  Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:

Bảo quản với các chất mang hút ẩm (silicagel), thường áp

dụng với các dạng nấm sợi

13

•  Bảo quản lạnh đông: Canh trường được nuôi trong ống

nghiệm, trộn với 10-30% chất chống đông (glycerol, dimethyl

sulfoxide), giữ ở -80ºC hoặc bảo quản trong nitrogen lỏng

(≈180ºC)

Bảo quản lạnh sâu (-80ºC)

Bảo quản trong nitrogen lỏng

14

•  Phương pháp đông khô (Freeze-drying): Canh trường được

làm lạnh đông và làm khô trong môi trường chân không

15

Ưu nhược điểm của các phương pháp bảo

quản lạnh sâu, trong nitrogen lỏng, đông khô

•  Ưu điểm: Bảo quản được số lượng lớn mẫu, tiết kiệm diện

tích không gian làm việc, tiết kiệm thời gian và công sức do

bảo quản và duy trì hoạt động sống của vi sinh vật ít nhất

2-20 năm.

•  Nhược điểm: Chi phí bảo quản cao, tế bào vi sinh vật có thể

bị vỡ khi giã đông (đặc biệt khi bảo quản ở nhiệt độ

≈-200ºC)

16

2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Phân loại theo thành phần và nguồn gốc: Có 3 loại

•  Môi trường tự nhiên: Có thành phần là các sản phẩm tự nhiên

như cao thịt bò, cao nấm men, khoai tây, rỉ đường, cám...

Khối lượng và thành phần hoá học của môi trường này không

xác định được một cách cụ thể và chính xác (?).

•  Môi trường tổng hợp: Chứa các chất hoá học mà thành phần

của chúng đều được xác định và định lượng cụ thể và chính

xác

•  Môi trường bán tổng hợp: Chứa cả các chất hoá học và sản

phẩm tự nhiên

17

2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Phân loại theo tính chất lý học: Có 3 loại

•  Môi trường lỏng: Thành phần môi trường không có agar (thạch), thường được sử dụng để nghiên cứu qúa trình sinh tổng hợp của vi sinh vật

•  Môi trường đặc (rắn): Chứa 1.5 – 2% agar hoặc 10-20% gelatin, thường sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật.

•  Môi trường bán lỏng: Chứa 0.3-0.7% agar, cả các chất hoá học và sản phẩm tự nhiên

Phân loại công dụng và mục đích:

•  Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau

•  Môi trường chọn lọc: Đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của một loài hay một nhóm vi sinh vật xác định nào đó

•  Môi trường kiểm định: Cho phép phân biệt được một số đặc điểm của một hoặc một số loài xác định (thông qua chất chỉ thị màu)

18. Yêu cầu của môi trường nuôi cấy vi sinh vật

•  Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết (nguồn carbon,

nitrogen, sulfur, vi lượng, vitamin,...), nước hoặc thạch.

•  Có độ pH thích hợp

•  Có độ nhớt nhất định

•  Không chứa các yếu tố độc hại

•  Tuyệt đối vô trùng (vô trùng hoặc tiệt trùng môi trường nuôi

cấy)

19. Một số môi trường dùng trong nghiên cứu vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy thích hợp sẽ phụ thuộc vào mỗi loài vi sinh vật khác nhau (vi khuẩn, nấm mốc, nấm men) và tuỳ từng mục đích cụ thể (phân lập, tuyển chọn, tăng sinh, làm giàu, sinh tổng hợp một enzyme nhất định)

20. Một số ví dụ:

LB (Lysogeny Broth, Luria-

YPD (yeast extract peptone

Bertani, Vi khuẩn)/ 1L

dextrose, Nấm men)/ 1L

•  1% yeast extract

•  2% peptone

•  2% glucose/dextrose

Môi trường đặc thêm 1.5-2% agar (? g); Môi trường chọn lọc: thêm kháng sinh hoặc bớt amino acid; Môi trường cảm ứng: bổ sung cơ chất cảm ứng

21

Tra cứu trên các website trực tuyến (Sigma-Aldrich,

Thermo Fisher Scientific...)

22

2.4. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

•  Phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp rắn, phương

pháp nổi, solid state fermentation)

•  Phương pháp nuôi chìm (phương pháp lỏng, phương pháp

bề sâu, liquid state fermentation)

23

Phương pháp nuôi cấy bề mặt

•  Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng như

cám gạo, khô cám, cám mỳ, ngô... (90–95%)có bổ sung vỏ

trấu hoặc mùn cưa (5-10%??) ở thể rắn đã được làm ẩm và

vô trùng. Các nguyên liệu này cung cấp đủ nguồn nitrogen,

carbon, vitamin, muối khoàng cho sự phát triển của vi sinh vật

•  Bổ sung (có thể có) thêm nitrogen vô cơ (ammonium sulfate -

(NH4)2SO4, sodium nitrate - NaNO3, urea (?) - CH4N2O hoặc

nitrogen hữu cơ (cao nấm men, cao ngô, dịch chiết malt)

•  Môi trường được làm ẩm 50-60%, khử trùng tại 120ºC/15-20

min và 1 at, làm nguội 30-40ºC.

•  Tiến hành cấy vi sinh vật, nuôi tại 28-37ºC/ 24-48 h tuỳ từng loại vi sinh vật (?)

24

Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Nguồn nguyên liệu

Tủ nuôi (ủ)

•  Ưu điểm: nồng độ enzyme cao, canh trường (cultrure) dễ vận

chuyển, tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường, tiết

kiệm điện năng

•  Nhược điểm: nuôi cấy gián đoạn, thủ công, tốn diện tích nuôi

cấy, năng suất thấp, tốn công lao động

25

Phương pháp nuôi chìm

•  Vi sinh vật phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng có sục khí liên tục

•  Môi trường dinh dưỡng cần đảm bảo các nguồn sau:

-  Nguồn carbon: Glucose, maltose, rỉ đường, tinh bột đã thuỷ phân, glycerol...

-  Nguồn nitrogen: Nitrogen vô cơ như (NH4)2SO4, NaNO3 (quyết định pH

môi trường??), CH4N2O hoặc nitrogen hữu cơ như cao nấm men, cao

ngô, dịch chiết malt, pepton...

-  Muối khoáng và vitamin: MgSO4, K2HPO4, KH2PO4, vitamin B1, B12

•  Môi trường dinh dưỡng được bơm vào thùng lên men. Khử

trùng môi trường bằng hơi nước nóng ở 120-125ºC/ 45-60

min, hạ nhiệt độ, bổ sung vi sinh vật, nuôi trong 24-48 h. Qúa

trình nuôi được sục khí liên tục và vô trùng tuyệt đối. Bổ sung

chất hoạt động về mặt (surfactant) làm chất phá bọt (anti-foam)

như tween 20, dầu ăn

26

Cơ chế phá bọt

Micelle (mixen) keo

Chất hoạt động bề mặt (Surfactant)

Cơ chế phá bọt của các

chất phá bọt (anti-foam

agent, defoamer)

27

Phương pháp nuôi chìm

•  Enzyme thường được tiết ra trong suốt qúa trình nuôi vi sinh

vật:

-  Enzyme ngoại bào: Kết thúc qúa trình nuôi có thể lọc, loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch enzyme, cô đặc thu chế phẩm thô hoặc tinh sạch để thu chế

phẩm có độ tinh khiết cao hơn

-  Enzyme ngoại bào: Cần phá vỡ tế bào (phương pháp xem phần trước), tinh chế enzyme

•  Nhược điểm: Nồng độ enzyme trong canh trường thấp, tốn

điện năng, giá thành cao, dễ bị nhiễm toàn bộ canh trường

nếu không đảm bảo vô trùng tuyệt đối

•  Ưu điểm: Có tính liên tục, dễ cơ giới hoá và tự động hoá,

năng suất cao, dễ điều khiển các thông số (nhiệt độ, pH, hàm

lượng oxy, thành phần dinh dưỡng...), enzyme ít lẫn tạp chất

(??)

28

Ưu và nhược điểm của hai phương pháp nuôi cấy

TT

Nuôi cấy bề mặt

Nuôi cấy chìm

1

Khó tự động hóa, năng xuất Dễ tự động hóa, năng suất

thấp, tốn diện tích nuôi cấy

cao, dễ tổ chức sản xuất

2

Khó khăn trong tinh chế

Dễ nuôi cấy chủng VSV đột

enzyme do cần trích ly

biến, enzyme tinh khiết

enzyme, enzyme tinh khiết

hơn

không cao

3

Ít bị nhiễm, ít gây nhiễm

Dễ gây nhiễm hàng loạt

hàng loạt

4

Phù hợp cho nuôi cấy nấm

Phù hợp với các VSV hô

mốc có khả năng phát triển

hấp yếm khí

nhanh

5

Giá thành thấp hơn, nồng độ Giá thành enzyme cao hơn

enzyme cao hơn

do nồng độ enzyme thấp